Charakterisierung kleiner Zinkfinger-Proteine in Haloferax volcanii

Diese Arbeit befasst sich mit der systematischen Charakterisierung von Zinkfinger-µ-Proteinen aus Haloferax volcanii. Kleine Proteine wurden bis vor einigen Jahren in der Forschung kaum beachtet. Die Verbesserung und Neuentwicklung von Techniken zur Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen führte jedoch dazu, dass immer mehr kleine Proteine experimentell identifiziert wurden. Ebenfalls konnte ein Mitwirken an vielen wichtigen biologischen Prozessen in verschiedenen Organismen bestätigt werden. Der halophile Modellorganismus H. volcanii besitzt laut aktueller Annotation über 40 Proteine, die kleiner als 70 Aminosäuren sind und mindestens zwei C(P)XCG-verwandte Motive aufweisen, welche häufig Zinkbindemotive sind. Während viele Vertreter eukaryotischer großer Zinkfinger-Proteine bereits untersucht worden sind, steckt die Erforschung archaealer Zinkfinger-µ-Proteine noch in den Kinderschuhen. Aufbauend auf einer vorangegangen Doktorarbeit und in Zusammenarbeit mit einigen Bachelor- und Masterstudierenden und in Kollaborationen wurden in dieser Arbeit nicht nur einige Fragen über diese Gruppe von Proteinen beantwortet, sondern auch Methoden eingeführt und etabliert, die eine weitere Erforschung in der Zukunft vereinfachen beziehungsweise ermöglichen sollen. Fünf bisher nicht untersuchte Deletionsmutanten wurden in dieser Arbeit durch verschiedene Experimente phänotypisch charakterisiert. Neben den bereits etablierten Konditionen wie Wachstum in verschiedenen Medien, Schwärm- und Biofilmverhalten wurde nun auch die Zellform während verschiedener Wachstumsphasen mit dem Wildtyp verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass einige Deletionen einen großen Einfluss auf die Stäbchenbildung der Zellen haben. Im Zusammenhang mit MS-Analysen der Deletionsmutanten konnte für einige Zinkfinger-µ-Proteine ein detaillierteres Bild von ihrer Funktion und ihrer Wirkweise gezeichnet werden. Die Deletionsmutante ∆HVO_0767 beispielsweise schwärmt langsamer als der Wildtyp und kann keine Stäbchen ausbilden. In MS-Analysen der Deletionsmutante stellte sich heraus, dass ein für die Stäbchenform und damit auch für die Schwärmfähigkeit essentielles Protein stark herunterreguliert vorlag. 14 putative Zinkfinger-Proteine ließen sich insgesamt in ausreichender Menge produzieren und reinigen, um deren Zinkgehalt zu bestimmen. Ein fluoreszenzbasierter Assay zeigte, dass nur 9 der Proteine tatsächlich Zink binden. Durch Massenspektrometrie konnte zusätzlich gesichert werden, dass mindestens drei der übrigen Proteine andere Metallionen als Zink binden, was darauf schließen lässt, dass die überwiegende Mehrheit der putativen Zinkfinger-Proteine tatsächlich Zink bindet oder zumindest nicht metallfrei ist. Eine weitere Methode, gebundene Metallionen zu identifizieren, wurde eingeführt. Hier wurde der Farbstoff Zincon verwendet, dessen Absorptionsspektrum abhängig vom komplexierten Metallion variiert. Nachdem in einer vorangegangenen Arbeit HVO_2753 detailliert untersucht worden war, wurde in dieser Arbeit als zweites Zinkfinger-µ-Protein HVO_0758 eingehend erforscht. Dazu zählen neben phänotypischen Untersuchungen auch in Kollaborationen erfolgte RNA-Seq-Studien und die NMR-Strukturaufklärung. Es konnte gezeigt werden, dass das verzögerte Wachstum der Deletionsmutante in Medium mit Glycerin nur dann auftritt, wenn die Zellen nicht bereits zuvor in diesem Medium angezogen wurden. Durch Northern Blots konnte bestätigt werden, dass die Abwesenheit von HVO_0758 zu einer starken Verringerung des Transkripts für ein TATA-Box Bindeprotein führt, was weitreichende Folgen für die Zelle haben kann. Basierend auf der NMR-Struktur und der Konserviertheit einiger Aminosäuren von HVO_0758 wurden Punktmutationen eingeführt, um deren Einfluss auf Struktur und Funktion zu testen. Die Konformationsänderungen, die bei HVO_0758 sowohl in Puffern mit niedriger Salzkonzentration als auch bei höheren Temperaturen mittels NMR beobachtet wurden, konnten durch ein Tryptophanfluoreszenz-Experiment bestätigt werden. Die Suche nach DNA-Interaktionspartnern lieferten keine eindeutigen Ergebnisse. Für das Protein HVO_0546 wurde per Co-Affinitätsreinigung nach Protein-Interaktionspartnern gesucht und das Helix-turn-Helix-Protein HVO_C0081 als vielversprechendster Kandidat identifiziert. Bei HVO_2345, einer Oxidoreduktase, wurde das Zinkfinger-µ-Protein HVO_2400 co-gereinigt, was die erste gegenseitige Co-Isolation für ein Zinkfinger-µ-Protein und einen potentiellen Interaktionspartner darstellt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Zinkfinger-µ-Proteine von H. volcanii teilweise andere Metallionen als Zink komplexieren und neben dem Schwärmverhalten und der Biofilmbildung auch Einfluss auf die Zellform haben. Außerdem konnten einige weitere Schritte zur Aufklärung der molekularen Mechanismen einiger Proteine gemacht werden.