Etude d'interactions protéine-ADN : Interactions Ku70/Ku80-ADN au sein de la voie NHEJ et caractérisation d'inhibiteurs d'une interaction protéine-ADN cible dans un contexte de recherche de médicaments

Pour qu’un organisme soit viable, il est essentiel que la molécule d’ADN soit dupliquée et transmise aux générations filles dans son intégralité avec le moins d’altérations possibles. Des cassures double-brin (CDB) peuvent apparaitre suite à des stress endogènes ou exogènes et constituent les dommages de l’ADN les plus toxiques. La radiothérapie a pour but générer de manière localisée des CDBs dans les cellules tumorales et de déclencher leur apoptose. Un enjeu majeur actuel est de comprendre le mécanisme de résistance de certaines tumeurs à ces CDBs et de caractériser de nouveaux inhibiteurs du NHEJ pour potentialiser l’effet de la radiothérapie. La voie NHEJ débute par la reconnaissance des deux extrémités de l’ADN d’une CDB par une protéine hétérodimérique Ku70/80 (Ku). Celle-ci sert de plateforme de recrutement aux autres facteurs de la voie NHEJ impliqués dans la maturation (processing) et la ligation des extrémités de l’ADN. Le premier volet de cette thèse a porté sur la caractérisation de sites d’interactions protéine-protéine de Ku et sur la caractérisation de nouvelles molécules comme médicaments potentiels dirigés contre Ku. Les sites d’interactions de deux partenaires majeurs de Ku, XLF et APLF, ont été caractérisés par calorimétrie en utilisant des peptides contenant le motif d’interaction de ces protéines appelés KBM (pour Ku-Binding Motifs) ou les protéines elles-mêmes. La structure cristallographique d’un complexe Ku-ADN avec une petite molécule, l’IP6, a été résolue. L’IP6 présente une forte affinité pour Ku avec un KD de 50 nM. Nous avons montré que cette molécule stimule la fixation de Ku sur l’ADN par trois méthodes biophysiques (calorimétrie, switchSENSE et sm-TIRF). Enfin, un criblage haut débit d’une chimiothèque de 987 molécules fragments de Sanofi a été réalisé in vitro par DSF et validé par RMN sur la protéine Ku. Ce crible a permis d’identifier 15 fragments susceptibles d’interagir avec Ku. Ces travaux ouvrent la voie pour la conception rationnelle d’inhibiteurs dérivés des peptides pXLF, pAPLF, de la molécules IP6 ou des fragments identifiés par le crible en greffant sur ces plateformes de nouvelles fonctions chimiques pour améliorer encore l’affinité et bloquer la voie NHEJ. Le second volet de cette thèse a porté sur des interactions de type protéine-ADN étudiées par Sanofi dans un projet de découverte de nouvelles drogues en oncologie et l’analyse de la valeur ajoutée d’une nouvelle approche le switchSENSE implémentée au CEA de Saclay. Nous avons analysé 4 constructions d’une protéine interagissant avec deux ADN et l’effet de 15 molécules inhibitrices identifiées en amont dans le service « Integrated Drug Discovery » de Sanofi. Les expériences de switchSENSE ont permis de caractériser les KD des 4 constructions pour l’ADN et de mesurer des constantes d’inhibition pour les inhibiteurs. Ces mesures sont en bon accord avec les mesures effectuées à Sanofi par SPR, MST et RMN et permettent de positionner le switchSENSE comme une approche prometteuse dans la validation de nouveaux inhibiteurs en particulier pour les interactions protéine-ADN.