Απομόνωση και ανασύσταση μυκητιακών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η χρήση μοριακών εργαλείων για την ανάπτυξη καινοτόμων προσεγγίσεων στη μελέτη και την περαιτέρω κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας του μεταφορέα πουρινών (UapA) στο νηματοειδή μύκητα Aspergillus nìdulans. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη αποτελεί ένα μοντέλο μελέτης για την ευρέως διαδεδομένη οικογένεια μεταφορέων NAT (Nucleobase Ascorbate Transporters). Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες μελέτες που αφορούν τη συγκεκριμένη κατηγορία διαμεμβρανικών πρωτεϊνών περιορίζονται στο επίπεδο των φυσιολογικών, μοριακών και γενετικών προσεγγίσεων, κυρίως λόγω των πειραματικών δυσκολιών που χαρακτηρίζουν την απομόνωση και τον καθαρισμό διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Οι σχέσεις δομής-λειτουργίας του UapA έχουν έως τώρα μελετηθεί μέσω του χαρακτηρισμού χιμαιρικών μορφών του μεταφορέα καθώς και πληθώρας σημειακών μεταλλαγών. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν αναφερθεί μελέτες που να αφορούν στο πρωτεϊνικό προϊόν του γονιδίου uapA. Με βάση τα παραπάνω, ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός του UapA σε πλήρως λειτουργική κατάσταση για περαιτέρω βιοχημικές, βιοφυσικές, φασματοσκοπικές, ανοσολογικές και φαρμακολογικές μελέτες καθώς και για προσπάθειες κρυστάλλωσης. Μέρος 1: Ανάπτυξη γενετικών και μοριακών «εργαλείων» για τη μελέτη της έκφρασης και απομόνωσης του μεταφορέα UapA. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής κατασκευάστηκαν και μελετήθηκαν στελέχη του A. nìdulans που θα επέτρεπαν τη μελέτη της έκφρασης και απομόνωσης της πρωτεΐνης UapA. Σε πρώτη φάση κατασκευάστηκαν, με μεθόδους μοριακής βιολογίας, πλασμιδιακοί φορείς που εκφράζουν, είτε από τον φυσικό είτε από ελεγχόμενο ισχυρό υποκινητή, την πρωτεΐνη UapA σημασμένη με διαφορετικούς πεπτιδικούς επίτοπους που θα επέτρεπαν τον ανοσοεντοπισμό, τον κυτταρικό εντοπισμό, αλλά και την απομόνωση της πρωτεΐνης. Οι φορείς αυτοί (UapA-BAD/C, UapA-His, αlc-UapA-His, UapA-RFP, UapA-GFP) εισήχθησαν με γενετικό μετασχηματισμό σε κατάλληλα στελέχη A. nidulans όπου η ενδογενής μορφή του UapA είχε απενεργοποιηθεί πλήρως (ΔuapA) και επιλεγμένα, μέσω φυσιολογικών και μοριακών αναλύσεων, στελέχη που έφεραν λειτουργική και σταθερή απλή ενσωμάτωσή τους στο γονιδίωμα χρησιμοποιήθηκαν για: α) τη μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού του UapA, β) τον προσδιορισμό των άριστων συνθηκών έκφρασής του UapA, γ) τον ανοσοχαρακτηρισμό της πρωτεΐνης και τη βελτίωση της απόδοσης της διαδικασίας αυτής, και τέλος δ) τον καθαρισμό της πρωτεΐνης. Αρχικά, η λειτουργικότητα των χιμαιρικών μορίων UapA-BAD/C, UapA- His, αlc-UapA-His, UapA-RFP, UapA-GFP ελέγχθηκε μέσω δοκιμασιών ανάπτυξης παρουσία πουρινών καθώς και μέσω της μελέτης της πρόσληψης ραδιοσημασμένων υποστρωμάτων από εκβλαστάνοντα κονιδιοσπόρια. Οι επίτοποι ιστιδίνης (His) και πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) δεν επηρέασαν καθόλου τη λειτουργικότητα (κινητικά χαρακτηριστικά, εξειδίκευση, στόχευση στη πλασματική μεμβράνη) του μεταφορέα σε αντίθεση με τους επίτοπους βιοτίνης (BAD/c-tail) και μονομερούς κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (RFP) οι οποίοι επηρέασαν σημαντικά τις κινητικές παραμέτρους του UapA. Η προσθήκη του επίτοπου RFP επηρέασε επιπλέον τη φυσιολογική τοπογένεση του UapA ως προς την κυτταρική μεμβράνη. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, για τη συνέχεια των μελετών μας επιλέχθηκαν τα σημασμένα με τους επίτοπους μόρια, UapA-His και UapA-GFP. Μέρος 2: Ανοσοανίχνευση του UapA. Αρχικά, η ανοσοανίχνευση του UapA πραγματοποιήθηκε σε μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα στελέχους το οποίο εκφράζει την πρωτεΐνη UapA-His, υπό το φυσικό υποκινητή της. Μετά από έναν αριθμό προσπαθειών, η πρωτεΐνη UapA ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε ανοσοκηλίδωμα Western στα 60 kDa χρησιμοποιώντας συνδυασμένο αντίσωμα anti-His HRP. Με δεδομένο ότι η έκφραση της πρωτεΐνης υπό το φυσικό υποκινητή ήταν πολύ χαμηλή, χρησιμοποιήσαμε το στέλεχος αlc-UapA-His στο οποίο η έκφραση του UapA ελέγχεται από τον πολύ ισχυρότερο και ελεγχόμενο (επαγόμενο από αιθανόλη-αναστελλόμενο από γλυκόζη) υποκινητή alcA. Με το συγκεκριμένο στέλεχος επιτεύχθηκαν πολύ υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του UapA (> 10 φορές αύξηση) σε σύγκριση με το φυσικό υποκινητή, γεγονός που διευκόλυνε σημαντικά τον καθαρισμό της πρωτεΐνης (Μέρος 4). Παρόλη την επιτυχία της παραπάνω προσπάθειας, θεωρήθηκε πως η όλη πειραματική διαδικασία καθαρισμού του μεταφορέα θα διευκολυνόταν περαιτέρω εάν χρησιμοποιούσαμε το βακτήριο E. coli ως σύστημα έκφρασης. Η προσπάθεια ετερόλογης υπερ-έκφρασης του κλωνοποιημένου cDNA του UapA στο E. coli δεν ήταν επιτυχής, καθώς η πρωτεΐνη UapA αποδείχτηκε ασταθής στα βακτήρια. Το γεγονός αυτό συμπίπτει με παρόμοιες προσπάθειες άλλων εργαστηρίων να εκφράσουν ευκαρυωτικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες σε βακτήρια. Παρόλα αυτά, η αλληλούχιση του κλωνοποιημένου cDNA του UapA επέτρεψε την επαναξιολόγηση της αλληλουχίας του γονιδίου uapΑ και της πρωτεΐνης UapA, γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα την επιδιόρθωση ορισμένων σφαλμάτων που είχαν παρατηρηθεί στο παρελθόν κατά την αλληλούχιση αρκετών μεταλλαγών του uapA. Οι διορθωμένες αλληλουχίες του γονιδίου uapA και της πρωτεΐνης UapA έχουν κατατεθεί σε σχετικές τράπεζες δεδομένων (Χ71807). Μέρος 3: Μελέτες ρύθμισης της έκφρασης του UapA. Πειραματικές βελτιώσεις στη διαδικασία ανοσοχαρακτηρισμού του σημασμένου με τον επίτοπο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης UapA (UapA-GFP) είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης υπό τον έλεγχο του φυσικού του υποκινητή. Το γεγονός αυτό μας έδωσε τη δυνατότητα μελέτης της ρύθμισης της φυσιολογικής έκφρασης του μεταφορέα, σε σύγκριση με έναν άλλο μεταφορέα πουρινών του A. nidulans, τον AzgA. Μετρώντας την πυκνότητα των ανοσοκηλιδωμάτων, πιστοποιήθηκε μια επαγωγή των επιπέδων UapA παρουσία πουρινών (περίπου 4-φορές) σε σχέση με την μη-επαγόμενη κατάσταση. Αντίθετα τα επίπεδα του AzgA επηρεάστηκαν ελάχιστα. Με την ίδια μεθοδολογία, η έκφραση του UapA φάνηκε να καταστέλλεται σημαντικά από την παρουσία ιόντων αμμωνίου, γεγονός που και πάλι δεν παρατηρήθηκε για τον AzgA. Χρησιμοποιώντας το στέλεχος με τον υποκινητή alcA (ο οποίος δε καταστέλλεται από τα αμμωνιακά ιόντα) πιστοποιήθηκε επίσης πως η πολύ σημαντική επίδραση των ιόντων αμμωνίου πάνω στα επίπεδα της πρωτεΐνης UapA, δεν οφείλεται μόνο σε αυξημένη μεταγραφική καταστολή όπως έχει υποστηριχτεί στο παρελθόν, αλλά επίσης στην επαγωγή ενός μηχανισμού ενδοκύτωσης και απενεργοποίησης της υπάρχουσας πρωτεΐνης στα χυμοτόπια. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε πλήρη συμφωνία με την επαγόμενη από τα ιόντα αμμωνίου εξαφάνιση του UapA-GFP από την κυτταρική μεμβράνη η οποία παρατηρήθηκε πρόσφατα σε μελέτες μικροσκοπίας επιφθορισμού. Μέρος 4: Καθαρισμός του UapA. Ο καθαρισμός του UapA επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μυκηλιακό εκχύλισμα το οποίο παράχθηκε κατά την αύξηση του μικροοργανισμού (στέλεχος αlc-UapA-His) σε συνθήκες άριστες για την έκφραση του UapA (νέο μυκήλιο υπό την απουσία ιόντων αμμωνίου). Για τον καθαρισμό χρησιμοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη Ni²⁺-NTA αφού προηγήθηκε αριστοποίηση των συνθηκών διαλυτοποίησης της πρωτεΐνης με τη βοήθεια της τασιενεργού ένωσης dodecyl-β-D-maltoside. Η καθαρότητα της πρωτεΐνης ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και βαφή του πηκτώματος με χρωστική Coomassie και νιτρικό άργυρο. Η πρωτεΐνη UapA καθαρίστηκε σχεδόν 100%, καθώς στα πηκτώματα SDS-PAGE εμφανίστηκε μόνο μια διπλή ζώνη η οποία αποτελείτο από μια ισχυρή και μια ασθενή ζώνη με ελάχιστα χαμηλότερο μοριακό βάρος. Αντίστοιχα αποτελέσματα ελήφθησαν τόσο στα πηκτώματα ηλεκτροφόρησης Native-PAGE όσο και στα πηκτώματα ανοσοκηλίδωσης κατά Western. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη UapA χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα ανασύστασης σε πρωτεολιποσώματα και πραγματοποιείται η πιστοποίηση της λειτουργικότητάς της με πειράματα πρόσληψης ραδιοσημασμένων ενώσεων. Παράλληλα, η λειτουργικότητα της απομονωμένης πρωτεΐνης UapA πιστοποιήθηκε σε πειράματα φθορισμομετρίας τρυπτοφάνης. Η όλη εργασία αποτελεί μια από τις σπάνιες περιπτώσεις καθαρισμού ενός ευκαρυωτικού διαμεμβρανικού μεταφορέα απ’ ευθείας από το φυσικό στέλεχος χωρίς τη χρήση ετερόλογων συστημάτων έκφρασης. Μέρος 5: Μελέτες ολιγομερισμού του UapA. Στο τελευταίο μέρος της εργασίας αναπτύξαμε και αξιολογήσαμε μοριακά εργαλεία για να χρησιμοποιηθούν στη μελέτη πιθανού, όπως έχουν υποδείξει προηγούμενες γενετικές μελέτες, ολιγομερισμού του UapA. Σε συμφωνία με τις γενετικές μελέτες, ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους από αυτήν του UapA παρατηρήθηκαν στα ανοσοκηλιδώματα κατά Western κατά τη διάρκεια των μελετών ρύθμισης της έκφρασης. Για να μελετηθεί περαιτέρω η συγκεκριμένη υπόθεση, κατασκευάστηκαν στελέχη τα οποία συνέκφραζαν διαφορικώς σημασμένους μεταφορείς (UapA, AzgA) και ένζυμα του μεταβολισμού πουρινών (Uaz-οξειδάση του ουρικού οξέος), που θα χρησιμοποιηθούν σε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης και «cross-linking» με στόχο τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους και της κατάστασης των πιθανών ολιγομερών του UapA. Οι συγκεκριμένες μελέτες θα καταδείξουν εάν ο UapA ομο- ή έτερο-ολιγομερίζεται, εάν αλληλεπιδρά με ένζυμα του μεταβολισμού των πουρινών, καθώς επίσης και την επίδραση του ενδεχόμενου ολιγομερισμού στη μεταφορική λειτουργία της πρωτεΐνης.