Σύγχρονη φαρμακογνωστική μελέτη του ενδημικού είδους Origanum dictamnus L. Έλεγχος ποιότητας των ειδών Salvia rosmarinus (L.) Schleid και Salvia officinalis L.

Το είδος Origanum dictamnus L., γνωστό ως «δίκταμο», έχει χρησιμοποιηθεί από την αρχαιότητα για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών και γυναικολογικών διαταραχών, καθώς και για την επούλωση πληγών. Σήμερα, το φυτό είναι καταχωρισμένο από τον ΕΜΑ ως Φυτικό Φαρμακευτικό Προϊόν Παραδοσιακής Χρήσης, και ενδείκνυται για την αντιμετώπιση του βήχα, την ανακούφιση από γαστρεντερικές διαταραχές και την επούλωση τραυμάτων. Στην Κρήτη, όπου το δίκταμο είναι ενδημικό είδος, χρησιμοποιείται ευρέως με τη μορφή εγχυμάτων και αφεψημάτων για την αντιμετώπιση των γαστρεντερικών ενοχλήσεων, ως επουλωτικό εξωτερικά και κατά της δυσμηνόρροιας, έχοντας ξεχωριστή σημασία στην τοπική παράδοση. Σε πρώτο στάδιο έγιναν εκτεταμένοι χρωματογραφικοί διαχωρισμοί προκειμένου να διερευνηθεί εις βάθος το χημικό περιεχόμενο του φυτού. Για το σκοπό αυτό ακολουθήθηκε μια μεταβολομική προσέγγιση που εξασφάλιζε, αφενός τη γρήγορη ταυτοποίηση γνωστών μεταβολιτών (dereplication), αφετέρου την ανίχνευση φυσικών προϊόντων-στόχων και τον εντοπισμό νέων φυσικών προϊόντων. Αυτό επιτεύχθηκε με το συνδυασμό δύο αναλυτικών τεχνικών, NMR και HPLC-PDA-MS, εκτός από την κλασική TLC, οι οποίες εισήχθησαν σε κάθε στάδιο της διαδικασίας. Πραγματοποιήθηκαν χρωματογραφικές απομονώσεις στα υπέργεια τμήματα και για πρώτη φορά στις ρίζες, ενώ μελετήθηκε και το χρωματογραφικό προφίλ του εγχύματος δικτάμου μέσω HPLC-PDA-MS. Συνολικά απομονώθηκαν/ανιχνεύθηκαν 44 ενώσεις, εκ των οποίων οκτώ δομές προσδιορίστηκαν φασματοσκοπικά για πρώτη φορά. Οι δομές διευκρινίστηκαν με φασματοσκοπία 1D- και 2D-NMR και όπου κρίθηκε σκόπιμο με κυκλικό διχρωισμό. Οι ενώσεις που περιγράφονται για πρώτη φορά είναι οι I4-II7-δι-καρβακρόλη (4) (Paloukopoulou et al., 2022), αβιετατριενο-3β,6β-διόλη (5), 2′′′-καφεουλο-απιγενινο-7-O-β-γλυκουρονοπυρανοσίδης (24), απιγενινο-7-Ο-[2′′′-καφεοϋλο-γλυκουρονοπυρανοσυλο-(1→2)] -Ο-γλυκουρονοπυρανοσίδης (25), λουτεολινο-7-Ο-[2′′′-καφεοϋλο-γλυκουρονοπυρανοσυλο-(1→2)]-Ο-γλυκουρονοπυρα νοσίδης (26), απιγενινο-7-O-[2′′′-φερουλοϋλο-γλυκουρονοπυρανοσυλο-(1→2)]-Ο-γλυκουρονοπυρανοσίδης (27), λουτεολινο-7-O-[2′′′-φερουλοϋλο-γλυκουρονοπυρανο συλο-(1→2)]-Ο-γλυκουρονοπυρανοσίδης (28) και το δεψίδιο διττανικό οξύ (37). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες για την αντιβακτηριακή, αντιμυκητιασική και αντικαρκινική δράση των ενώσεων. Η αφορμή για την εξέταση της αντιμικροβιακής τους δράσης προήλθε από τις εθνοφαρμακολογικές αναφορές που αναφέρουν τη χρήση της δρόγης για την ανακούφιση από τον πονόλαιμο σε κρυολόγημα, καθώς και από τη βιβλιογραφία που επικεντρώνεται κυρίως στα αιθέρια έλαια. Η αντιβακτηριακή δράση των ενώσεων αξιολογήθηκε σε βακτηριακά στελέχη όπως το Staphylococcus aureus (ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη) και το Pseudomonas aeruginosa (ανθεκτικό στις καρβαπενέμες). Επιπλέον, δεδομένου ότι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι φαινολικές ενώσεις μπορούν να λειτουργούν ως αναστολείς της καρβονικής ανυδράσης, διερευνήθηκε μια ευρύτερη ποικιλία φαινολικών δομών του Origanum dictamnus για την ανασταλτική τους δράση έναντι της μυκητιασικής β-MgCA, καθώς και την αντιμυκητιασική τους δράση κατά του στελέχους Malassezia globosa. Τα δεψίδια του φυτού σαλβιανολικό οξύ P και διττανικό οξύ μελετήθηκαν για την αναστολή τους έναντι των σχετιζόμενων με καρκίνο ανθρώπινων ισομορφών hCA IX και XII, της καρβονικής ανυδράσης. Οι ενώσεις έδειξαν σημαντική ανασταλτική δράση κατά της ισομορφής hCA IX, ενώ ανέστειλαν αποτελεσματικά και τη δεύτερη ισομορφή hCA XII. Ο τρόπος δέσμευσης των προσδετών στο ένζυμο, μελετήθηκε μέσω κρυσταλλογραφίας και έδειξε ότι το σαλβιανολικό οξύ P συνδέεται δημιουργώντας πολλές σταθεροποιητικές αλληλεπιδράσεις, τόσο μέσα στο ενεργό κέντρο, όσο και στα όρια της δομής του ενζύμου. Τέλος, οι ενώσεις αξιολογήθηκαν για την κυτταροτοξικότητά τους σε πρότυπη ανθρώπινη κυτταρική σειρά από τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού (MDA-MB-231), και παρουσίασαν σημαντική κυτταροτοξική δράση. Λαμβάνοντας υπόψη την εθνοφαρμακολογική χρήση του φυτού στις γαστρεντερικές διαταραχές, διεξήχθησαν προκαταρκτικά πειράματα με απομονωμένο έντερο κουνελιού, τα οποία έδειξαν τη χαλαρωτική δράση του εγχύματος δικτάμου. Αυτό μας ώθησε στο να εξετάσουμε τον τρόπο που τα συστατικά του δικτάμου επηρεάζονται από τις πεπτικές διεργασίες στην από του στόματος χορήγηση του εγχύματος. Για τον σκοπό αυτό, διεξήχθησαν οι ακόλουθοι πειραματισμοί: i) ex vivo αξιολόγηση εντερικής διαπερατότητας, ii) in vitro προσομοίωση πέψης στις τρεις φάσεις (στοματική, γαστρική και εντερική) και iii-iv) έλεγχος σταθερότητας του εγχύματος παρουσία/απουσία του εντερικού ιστού. Τέτοιου είδους δεδομένα δεν περιλαμβάνονται στην επίσημη Μονογραφία της Ευρωπαϊκής Κοινότητας. Το έγχυμα παρασκευάστηκε σύμφωνα με το σχήμα δοσολογίας του EMA. Το ex vivo πείραμα διαπερατότητας πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του μη ανεστραμμένου εντερικού σάκου (non-everted gut sac method) σε νήστιδα από έντερο κουνελιού. Κάθε εντερικός σάκος πληρώθηκε με έγχυμα δικτάμου, και τοποθετήθηκε σε γυάλινους περιέκτες σε υδατόλουρο στους 37 °C. Δείγματα από το περιεντερικό διάλυμα συλλέχθηκαν σε καθορισμένους χρόνους και αναλύθηκαν με HPLC-PDA-MS. Η μελέτη της in vitro πέψης πραγματοποιήθηκε σε τρία στάδια, και έγινε αξιολόγηση της δραστικότητας των ενζύμων: i) της αμυλάσης (στοματική φάση), ii) της πεψίνης παρουσία HCl σε pH 2 (γαστρική φάση), iii) της παγκρεατίνης και θρυψίνης, καθώς και των χολικών αλάτων σε pH 6,5 (εντερική φάση). Ο έλεγχος της εντερικής διαπερατότητας έδειξε ότι το παράγωγο 1 του Σαλβιανολικού οξέος P εμφάνισε την υψηλότερη διαπερατότητα, φτάνοντας τα 12,59 μg/cm2. Στη μελέτη in vitro πέψης διαπιστώθηκε ότι τα συστατικά του εγχύματος υφίστανται ενζυμική διάσπαση, τόσο στη γαστρική, όσο και στην εντερική φάση, με το αποτέλεσμα να είναι πιο έντονο στην εντερική φάση. Στις πειραματικές συνθήκες που προσομοιώνουν το εντερικό περιβάλλον (π.χ. ρυθμιστικό διάλυμα, θερμοκρασία και επίπεδα οξυγόνου), τα λιγνάνια παρουσίασαν την υψηλότερη διάσπαση, φτάνοντας σε ποσοστό 50-60%, ενώ παρουσία του εντερικού ιστού παρατηρείται περαιτέρω διάσπαση για όλες τις ενώσεις με το δεψίδιο 9 (παράγωγο 2 του Σαλβιανολικού οξέος P) να πλησιάζει το 78%. Αυτή η τάση αποικοδόμησης ήταν κοινή στα συστατικά που περιείχαν εστερικές ομάδες. Οι αναφορές του ΕΜΑ για την ηρεμιστική δράση του εγχύματος δικτάμου στο γαστρεντερικό σύστημα και του διττού τρόπου δράσης του, τόσο ως εκτρωτικό, όσο και ως σπασμολυτικό, μας οδήγησαν στην επιστημονική διερεύνηση αυτών των αναφορών. Είναι χαρακτηριστικό ότι δεν υπάρχουν σύγχρονα δεδομένα που να αποδεικνύουν τη δράση αυτή. Προκειμένου να καλυφθεί το κενό αυτό, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η φαρμακοδυναμική δράση εγχύματος δικτάμου στο απομονωμένο έντερο κουνελιού. Οι πειραματισμοί πραγματοποιήθηκαν σε παρασκευάσματα από μοίρες του λεπτού (νήστιδα) και του παχέος εντέρου (ανιόν κόλον). Παράλληλα, το έγχυμα αναλύθηκε ποσοτικά μέσω HPLC-PDA-MS προκειμένου να συνδεθεί η χημική του σύσταση με τη φαρμακολογική απόκριση. Το έγχυμα του δικτάμου προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη χαλάρωση στο έντερο κουνελιού, καθώς μείωσε, τόσο τη συχνότητα και το εύρος των συσπάσεων, όσο και τον βασικό τόνο των παρασκευασμάτων του ανιόντος κόλου και της νήστιδας, με το ανιόν κόλον να εμφανίζεται πιο ευαίσθητο. Έτσι επιβεβαιώνεται επιστημονικά η εθνοφαρμακολογική χρήση του φυτού. Επιπλέον, τα πειράματά μας δείχνουν ότι τα μη πτητικά, υδατοδιαλυτά, φαινολικά συστατικά είναι υπεύθυνα για αυτό το χαλαρωτικό αποτέλεσμα. Πιλοτικά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε εντερικά παρασκευάσματα κουνελιού έδειξαν ότι το ροσμαρινικό οξύ, σε συγκεντρώσεις πολύ χαμηλότερες συγκριτικά με αυτές του δικτάμου, είχε μια χαλαρωτική επίδραση, τόσο στη νήστιδα, όσο και στο ανιόν κόλον. Όμως, η παρουσία και άλλων δεψιδίων σε αρκετά μεγάλη συγκέντρωση στο έγχυμα, όπως μαρτυρά η ποσοστιαία σύσταση αυτού, υποδεικνύουν ότι και οι υπόλοιπες ενώσεις χρήζουν φαρμακοδυναμικής διερεύνησης. Με βάση τα αποτελέσματα της δράσης του δικτάμου στο έντερο, αποφασίστηκε η περαιτέρω μορφοποίηση σε καινοτόμες φαρμακοτεχνικές μορφές προοριζόμενες για per os χορήγηση. Επιλέχθηκε ο σχεδιασμός υμενίων με ενθυλακωμένο το έγχυμα δικτάμου. Προς τούτο, αρχικά προσδιορίστηκε ποσοτικά το ροσμαρινικό οξύ, που είναι ο κύριος μεταβολίτης του εγχύματος, και χρησίμευσε ως δείκτης για τον χαρακτηρισμό του παρασκευάσματος. Ακολούθως το έγχυμα μορφοποιήθηκε με πολυβινυλική αλκοόλη και χιτοζάνη σε υμένια μέσω της μεθόδου της ηλεκτροϊνοποίησης. Τα παραχθέντα υμένια χαρακτηρίστηκαν για τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, ενώ η περιεκτικότητά τους σε έγχυμα αποδείχθηκε ικανοποιητική και βιομηχανικά βιώσιμη, κυμαινόμενη από 88,7 – 90,0% και 82,6 – 85,8% ροσμαρινικού οξέος. Τέλος, τόσο τα υμένια, όσο και το έγχυμα δεν παρουσίασαν καμία κυτταροτοξική δράση αποδεικνύοντας την ασφαλή χρήση τους. Στο τελευταίο τμήμα της διδακτορικής διατριβής ασχοληθήκαμε με την ανάπτυξη μεθοδολογίας HPLC-PDA για τον προσδιορισμό του καρνοσικού οξέος και της καρνοσόλης στα φρέσκα φύλλα δενδρολίβανου και φασκόμηλου. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του προγράμματος ΒΙΟΦΑΡΜ με στόχο τον εντοπισμό γενότυπων ελληνικού που να παράγουν υψηλές ποσότητες καρνοσικού οξέος. Αναπτύχθηκε ένα γρήγορο πρωτόκολλο RP-HPLC το οποίο βελτιστοποιήθηκε περαιτέρω, ενώ η μεθοδολογία επικυρώθηκε για πιστότητα και ακρίβεια σύμφωνα με τις οδηγίες του ICH. Η πιστότητα της συνολικής μεθόδου (εκχύλιση και HPLC) ήταν αποδεκτή με % τιμές RSD που κυμαίνονταν μεταξύ 1,42 και 4,35. Η ανάκτηση κυμάνθηκε μεταξύ 85,1% και 104,6% με τιμές RSD < 5%, εντός των αποδεκτών ορίων. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε ήταν γρήγορη και απλή και επέτρεψε τον γρήγορο και ακριβή προσδιορισμό του καρνοσικού οξέος και της καρνοσόλης στους φρέσκους ιστούς. Η μεθοδολογία εφαρμόστηκε στην ποσοτική ανάλυση αρκετών καλλιεργημένων δειγμάτων S. rosmarinus και S. officinalis και ορισμένα από αυτά έδειξαν ότι είναι καλής ποιότητας αρχικά υλικά για την ανάπτυξη ελληνικών γενότυπων πλούσιων σε καρνοσικό οξύ.