Analyses pharmacologiques et génétiques de la régulation épigénétique dans le pathogène humain Leishmania

L’incidence des leishmanioses est en progression constante et les principales raisons en sont le manque de mesures préventives, un arsenal thérapeutique spécifique restreint, ou encore l’apparition de parasites résistants aux principes actifs des anti-leishmaniens courants. Mes travaux de thèse ont consisté, d’une part à développer de nouvelles techniques de criblages de molécules à visée anti-Leishmania et de les appliquer sur plusieurs banques de composés et, d’autre part, de déterminer si des mécanismes épigénétiques pouvaient être impliqués dans la régulation de l’expression des gènes chez les leishmanies et dans la subversion de la cellule hôte et la survie intramacrophagique de Leishmania. L’approche pharmacologique a été basée sur l’utilisation de tests mesurant l’activité anti leishmanie à la fois sur la forme cliniquement pertinente c’est-à-dire l’amastigote intramacrophagique et sur la forme libre présente chez le phlébotome, le promastigote. La combinaison des tests effectués sur les différents stades de développement et sur deux espèces de leishmanie, l’une dermotrope et l’autre viscérotrope, a permis de proposer une nouvelle procédure permettant de mieux appréhender l’activité anti-leishmanienne et la toxicité vis-à-vis des cellules hôtes des composés testés. Sur 722 composés testés, 225 ont montré une activité anti-parasitaire intéressante selon l’espèce, le stade et la concentration, dont certains étaient classés comme inhibiteurs épigénétiques. Cette approche pharmacologique a permis de mettre en évidence un rôle potentiel de l’épigénétique dans deux aspects de la biologie de Leishmania, que j’ai étudié par la suite. Tout d’abord, par une approche phylogénétique, j’ai révélé l’importance potentielle de l’épigénétique dans la biologie de Leishmania. J’ai analysé les génomes de 4 espèces de Leishmania et trouvé des gènes présumés codant pour des enzymes modifiant les histones, régulant la méthylationet l’acétylation. Je me suis ensuite intéressée aux modifications post-transcriptionnelles potentielles de l’histone H3. Un alignement de séquences multiples des histones H3 de différents mammifères et de Leishmania montre 60% d’homologie, avec d’importantes différences dans la queue N-terminale, suggérant une compaction de l’ADN et une régulation de l’expression des gènes spécifiques au parasite. En revanche, certaines modifications d’acides aminés de H3 sont conservées et ont été révélées dans des analyses d’immunofluorescence chez le promastigote en utilisant des anticorps commerciaux ciblant la méthylation de H3K4, H3K23, H3K27 et H3K36. Les modifications épigénétiques spécifiques ou conservées du parasite pourraient être des cibles thérapeutiques intéressantes chez Leishmania, et j’ai d’ailleurs étudié le mode d’action de deux catégories d’inhibiteurs épigénétiques. Par ailleurs, par le criblage de librairies d’inhibiteurs épigénétiques, j’ai découvert des composés ayant uniquement une activité sur les amastigotes intracellulaires, suggérant une implication des mécanismes épigénétiques dans la survie intracellulaire du parasite. J’ai révélé par des analyses d’immunofluorescence et de western blot différents niveaux de méthylation des histones entre les macrophages non infectés et infectés, montrant une possible modulation de la régulation épigénétique de la cellule hôte par Leishmania afin de promouvoir sa survie intracellulaire. Pour évaluer cette hypothèse, j’ai conduit une analyse de séquençage de l’ARN pour étudier le mode d’action des inhibiteurs des déméthylases des histones, qui pourraient agir sur les mécanismes de régulation épigénétique du macrophage afin de restaurer ses propriétés leishmanicides. Ce travail pourrait permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’interaction hôte pathogène, dont certaines pourraient avoir un mode d’action via l’hôte, ce qui aurait l’avantage d’éviter la génération de parasites résistants.