Χαρακτηρισμός εναλλακτικού μεταγράφου της πολυ(Α)-εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης, PARN, και διερεύνηση του βιολογικού του ρόλου

Η πολυ(Α) εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN) είναι μια αποδενυλάση, ένας τελεστής της αποικοδόμησης του ευκαρυωτικού mRNA που μεσολαβεί στην ρύθμιση της σταθερότητας ποικίλων μη κωδικών RNA. Όπως είναι κοινό για τα περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, το γονίδιο της PARN κωδικοποιεί πολλαπλά εναλλακτικά μετάγραφα, τα οποία έχουν ανιχνευθεί από προηγούμες μελέτες αλληλούχισης. Τα εναλλακτικά μετάγραφα της PARN δεν έχουν χαρακτηριστεί βιοχημικά ή μελετηθεί ειδικά. Σε αυτή την εργασία ανιχνεύσαμε την έκφραση ενός εναλλακτικού μεταγράφου της PARN σε κυτταρικές σειρές κακοήθους μεσοθηλιώματος υπεζωκότα (PMM) και ινοβλάστες πνεύμονα, το εναλλακτικό μετάγραφο PARN_v1, συνεκφράζεται με την PARN στις κυτταρικές σειρές μεσοθηλιώματος αλλά όχι στους πνευμονικούς ινοβλάστες. H PARN_v1 εκφράζεται σε επίπεδο mRNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης, σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται και από τους τρεις υποτύπους κακοήθους μεσοθηλιώματος του υπεζωκότα, ενώ είναι μη ανιχνεύσιμη σε καλοήθη υπεζωκοτικά αθανατοποιημένα κύτταρα. Τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης ανιχνεύθηκαν στους πνευμονικούς ινοβλάστες. Η κωδική περιοχή της PARN_v1 ταυτοποιήθηκε, κλωνοποιήθηκε, υπερεκφράσθηκε και χαρακτηρίστηκε βιοχημικά το πρωτεϊνικό του προϊόν. Η κλωνοποίηση και η ανάλυση αλληλουχίας της έδειξαν ότι σε σύγκριση με το mRNA της PARN η PARN_ν1 υστερεί κατά 83 βάσεων από το 3' άκρο του εξονίου 1, αυτή η περιοχή περιλαμβάνει το αρχικό κωδικόνιο έναρξης του PARN, οδηγώντας έτσι τη μετάφραση της PARN_v1 από ένα καθοδικό κωδικονίου έναρξης που βρίσκεται στο εξόνιο 4. Η πρωτεΐνη που προκύπτει στερείται μιας μεγάλης περιοχής 61aa της αρχικής περιοχής νουκλεάσης PARN, συμπεριλαμβανομένων δύο από τα κύρια καταλυτικά υπολείμματα D28 και D30. Το καθαρισμένο πρωτεινικό προιόν της PARN_ν1 διατηρεί την ικανότητά της να αποαδενυλιώνεται πιθανώς μέσω της στερικής υποκατάστασης των D28 και D30 από D292 και E378 αντίστοιχα. Για να εξεταστεί ο βιολογικός ρόλος της PARN_v1, πραγματοποιήθηκε η σίγησή της στους πνευμονικούς ινοβλάστες και υποβλήθηκε σε φασματομετρία μάζας, αποκαλύπτοντας τον ρόλο του στην κυτταρική προσκόλληση και στις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με την εξωκυττάρια ουσία. Μετά τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε καρκικικούς ινοβλάστες με την επώασή τους με μέσο κυτταροκαλλιέργειας από κύτταρα καρκίνου του μαστού, αλλά και εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα καρκίνου του μαστού, τα επίπεδα PARN_v1 μειώθηκαν σημαντικά και η έκφραση PARN ενεργοποιήθηκε. Τέλος, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο απομόνωσης εξωσωμάτων για τη γρήγορη ανίχνευση εξωσωματικών βιοδεικτών RNA στο υπεζωκοτικό υγρό.