Etude fonctionnelle des glycoprotéines d'enveloppe du réservoir VIH-1

Le réservoir VIH-1 des lymphocytes T CD4+ quiescents présente seulement une faible proportion de génomes intacts. La fonctionnalité des protéines virales codées par ces séquences n’a pas encore été complétement élucidée. Lors de cette étude, je me suis concentrée sur l’expression et la fonctionnalité de la glycoprotéine d’enveloppe du VIH, qui est une cible majeure du système immunitaire et un important agent pathogène. Les lymphocytes T CD4+ quiescents ont été isolés à partir de prélèvements sanguins de patients sous traitement antirétroviral dont la charge virale était contrôlée depuis plus de 4 ans. Les séquences du gène env ont été obtenues à partir de deux sources : soit les cellules ont été stimulées et cultivées en condition de dilution limite avec des cellules cibles pour permettre la propagation de virus clonaux en culture (VOA), soit les ARN viraux produits par les cellules après stimulation ont été extraits et amplifiés par RT-PCR. Les gènes env ont été clonés dans un plasmide d’expression et séquencés. L’expression des protéines a été quantifiée par Western Blot, cytométrie, et immunofluorescence. La fonctionnalité des glycoprotéines d’enveloppe a été mesurée par un test de fusion cellule-cellule et un test d’infectivité de pseudo-particules virales. Toutes les séquences env issues des VOA sont intacts alors que 26% de celles dérivées des ARNm des LT CD4+ quiescents présentent des mutations. Plus le patient est traité précocement, plus la diversité virale de son réservoir est restreinte. Pour les tests de fusion et d’infectivité, seules les séquences intactes ont été testées. Les enveloppes du réservoir VIH-1 ne sont pas toutes fonctionnelles : une grande proportion des Envs dérivées des ARNm (27.5%) sont peu fonctionnelles par rapport au contrôle positif (< 25%) et 14% ne présentent aucune activité fusogénique détectable. Les enveloppes des virus de VOA sont plus fusogéniques que celles dérivées des ARNm : 90% des enveloppes des virus de VOA sont au dessus de 50% de la fonctionnalité du contrôle positif contre seulement 41% pour les enveloppes dérivées des ARNm. L’étude des glycoprotéines d’enveloppe par Western Blot et par cytométrie a permis d’établir respectivement une corrélation entre leur niveau d’expression et leur fonctionnalité ainsi qu’entre le nombre de cellules les exprimant à leur surface et leur fonctionnalité. Les défauts de fusogénicité et d’infectivité des Env du réservoir sont essentiellement dus à un problème d’expression, de maturation, de stabilité et/ou d’adressage à la surface cellulaire. Ces défauts pourraient contribuer à l’accumulation de séquences apparemment intactes mais défectueuses au sein du réservoir VIH-1. En outre, ces glycoprotéines d’enveloppe pourraient échapper à l‘immunité lors des stratégies de « kick and Kill ».