Approches de glycomique appliquées à l'étude des pathologies métaboliques des glycoprotéines

Les glycannes des glycoprotéines sont impliqués dans de multiples processus biologiques, tels que l'inflammation, l'immunité, le développement et la reproduction. Ils sont responsables des nombreuses propriétés physicochimiques, immunologiques et biologiques des glycoprotéines. Ils peuvent, de fait, moduler les propriétés pharmacologiques des glycoprotéines recombinantes thérapeutiques. Leur importance a également été démontrée par la sévérité des présentations cliniques et les taux de morbidité / mortalité de CDG. Cependant, la médecine moderne manque cruellement d'outils glycobioanalytiques permettant l'exploration de ces métabolismes, à grand échelle. Les objectifs de notre thèse étaient donc fondés sur la mise au point d'approches et d'outils glycobioanalytiques, basés sur l'utilisation de la spectrométrie de masse appliqués à l'étude de la glycosylation d'une glycoprotéine d'intérêts biologiques, l'a-mannosidase lysosomale (LAMAN), et à l'étude de fluides biologiques d'intérêts, tels que le plasma sanguin et l'urine, qui regorgent de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques spécifiques, formés au cours de pathologie congénitales de la biosynthèse (CDG) et du catabolisme (glycoprotéinoses) des glycoprotéines. La première partie de notre travail de thèse a consisté en la caractérisation structurale de la glycosylation de la LAMAN bovine, qui constitue notre modèle d'étude de la LAMAN humaine et de la pathogénése moléculaire de l'a-mannosidose. Nous avons pu déterminer la structure détaillée d'une vingtaine de N-glycannes ainsi que leur positions sur six des huit sites de glycosylation de la LAMAN bovine. Les résultats obtenus constituent un base solide pour l'étude de la glycosylation de la LAMAN humaine recombinante, dédiée à l'évaluation de son efficacité thérapeutique dans le traitement expérimental de l'a-mannosidose. La seconde partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point de méthodologies de glycomique dédiées au profilage et à la caractérisation structurale de glycobiomarqueurs urinaires diagnostiques des glycoprotéinoses. Dans un premier temps, nous décrivons une méthode de profilage complet des oligosaccharides et de glycoasparagines urinaires perméthylés, par MALOI-TOF-MS, reflets du catabolisme Iysosomal de glycoprotéines cellulaires, par la microanalyse de 20 µL d'urine de patients. Dans un second temps, appliquée, à l'étude des oligosaccharides urinaires d'un patient atteint d'une ß-mannosidose, nous avons pu identifier et partiellement caractériser neuf nouvelles structures, jamais décrites chez l'homme. Enfin, la dernière partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point d'une approche glycobioanalytique globale permettant d'explorer les processus de g!ycosylation des protéines. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de profilage rapide du N- et du O-glycome des glycoprotéines sériques totales par MALOI-TOF-MS, par la microanalyse de 30 µL de sérum, permettant la détection et la caractérisation de glycofonnes anormales, formées au cours des CDG. Appliquées au sérum de patients souffrant de CDG-lla et d'une déficience en protéine COG 1, cette stratégie a permis de mettre en évidence et de caractériser de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques de ces maladies