Caractérisation d'aptamères par électrophorèse capillaire couplée au séquençage haut-débit Illumina

Les aptamères sont des oligomères d'ADN ou d'ARN simple brin qui, en se repliant sous forme de structures tridimensionnelles peuvent avoir des interactions fortes et spécifiques envers un certain nombre de cibles. L'objectif de cette thèse a été de compléter les études existantes sur l'utilisation de l'électrophorèse capillaire (CE) et les aptamères afin de mettre au point une méthode de sélection d'aptamères par CE couplée à la fluorescence induite par laser et le séquençage haut-débit Illumina. Dans un premier temps, nous avons mis au point une méthode de détection et de séparation par électrophorèse capillaire couplée à la double détection UV-LEDIF d'une banque d'ADN en interaction avec une cible : la thrombine. C'est un modèle déjà étudié pour lequel deux aptamères ont fait l'objet de publications. Nous avons utilisé l'aptamère T29 dans le cadre de notre étude car c'est celui qui présente la meilleure affinité. L'électrophorèse capillaire est un puissant outil analytique qui facilite l'efficacité de sélection des aptamères et précise la détermination des paramètres d'interactions. Nous avons ainsi pu déterminer la constante d'affinité KD par CE-UV-LEDIF sur le modèle de base : la thrombine. Par ailleurs, nous montrons également comment l'utilisation du tampon Tris peut dégrader un ADN simple brin en électrophorèse capillaire et nous proposons comme alternative l'utilisation d'un tampon sodium phosphate dibasique qui évite ce phénomène de dégradation. Enfin, nous expliquons la difficulté d'amplification par qPCR et PCR d'un aptamère comme le T29 ayant une structure en G-quadruplex. Nous avons montré que le séquençage haut-débit Illumina nous a permis de trouver une corrélation entre le nombre de molécules séquencées et le nombre de séquences obtenues. L'analyse des séquences obtenues montre une quantité importante (20%) de séquences de T29 qui ne correspondent pas à la séquence de cet aptamère. Cela prouve que les étapes de PCR et de séquençage haut débit pour la détection de G-quadruplex peuvent induire un biais dans l'identification de ces molécules.