Développement de nouvelles méthodes de préparation de l'échantillon d'urine, de préconcentration et d'analyse reposant sur l'électrophorèse capillaire pour la détection d'hormones peptidiques illicites chez les sportifs

Actuellement, le dépistage d'un grand nombre de substances illicites dans l'urine des sportifs est effectué après une dilution non sélective de l'échantillon. Cette approche est principalement utilisée pour la détection de composés présents à des concentrations relativement élevées dans l'urine (10-100 ng/mL) et ayant un métabolisme limité. Lorsqu'il s'agit de traces de peptides de grande taille tels que les analogues de l'hormone libératrice de l'hormone de croissance (GHRH), de l'insuline ou encore de l'Insuline-like Growth Factor-1 (IGF-1), des méthodes d'immuno-purification sont fréquemment utilisées. Cependant, elles présentent des limitations liées à la perte éventuelle d'échantillon et au risque de contamination croisée. Outre la préparation de l'échantillon, l'analyse des hormones peptidiques peut être difficile à réaliser notamment pour les analogues de la GHRH qui n'ont jamais été séparés analytiquement. De plus, la sermoréline et la CJC-1293 ne peuvent être différenciées par spectrométrie de masse en raison de leur chaîne peptidique ne variant que par l'énantiomérie d'un seul acide aminé. L'objectif de cette thèse vise à développer des méthodes sensibles sans utiliser l'immunoaffinité. Deux stratégies focalisées chacune sur les différentes étapes d'une méthode analytique (préparation de l'échantillon, préconcentration et analyse) ont été étudiées. Nous nous sommes intéressés aux hormones peptidiques interdites par l'Agence Mondiale Antidopage (AMA) comme les analogues de la GHRH, l'insuline et l'IGF-1. La première stratégie est liée au traitement de l'échantillon qui permet d'extraire de l'urine les peptides étudiés (analogues de la GHRH, l'insuline, l'IGF-1 et synacthène) tout en les concentrant. Différents types d'interactions (immunoaffinité, hydrophiles et hydrophobes) ont été envisagés pour capturer ces peptides sur des billes magnétiques. Nous avons comparé les rendements d'extraction pour chacune des familles de peptides sur les billes différemment fonctionnalisées afin de déterminer lesquelles présenteraient une meilleure interaction que l'immunoaffinité pour extraire ces différentes familles de peptides de l'urine. La seconde stratégie porte sur la séparation des quatre analogues de la GHRH les plus connus. L'électrophorèse capillaire (CE) chirale a été développée pour séparer deux analogues de la GHRH qui ne diffèrent que par l'énantiomérie d'un seul acide aminé (Ala2). Une très bonne résolution a été obtenue pour la première fois en utilisant une cyclodextrine comme sélecteur chiral et un revêtement de capillaire cationique afin d'éviter l'adsorption de ces peptides très basiques sur la paroi du capillaire. Puis, pour améliorer la sensibilité de détection de ces peptides, différentes techniques de préconcentration électrocinétique couplées en ligne avec la CE chirale ont été étudiées (Field Amplified Sample Stacking, Dynamic pH junction, Sweeping, et Large Volume Sample Stacking) pour pouvoir concentrer les analytes avant leur séparation et détection au sein d'un même capillaire. L'optimisation de la LVSS-CE chirale a permis d'obtenir un facteur d'enrichissement (SEF) de 170 pour les 4 analogues de la GHRH, solubilisés initialement dans l'eau, permettant d'atteindre une limite de détection (LOD) entre 75 et 200 ng/mL. L'application de cette méthode de LVSS-CE chirale sur l'urine nécessite une étape de dessalage préalable de l'échantillon en vue d'obtenir une matrice de faible conductivité, essentielle pour la réalisation du LVSS. Nous avons comparé plusieurs stratégies de dessalage comme la filtration sur membrane et l'extraction sur phase solide (SPE). Le dessalage le plus efficace et le meilleur rendement d'extraction (89 %) de la sermoréline présente dans l'urine ont été obtenus avec la SPE C18. La méthode de LVSS-CE chirale appliquée à des échantillons d'urine prétraités par SPE a permis d'obtenir un SEF de 685 et une LOD de 50 ng/mL pour la sermoréline, valeur proche du minimum requis par l'AMA.