Etude structurale et fonctionnelle des substances apparentées d’anticorps thérapeutiques

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des protéines complexes qui doivent être caractérisées de façon exhaustive en respectant la réglementation dictée par les autorités de santé pour assurer la sécurité et l'efficacité du produit. Les mAbs présentent une micro-hétérogénéité structurale principalement liée à des modifications post- traductionnelles mais également à des dégradations physiques et chimiques. L’instabilité des protéines peut être causée par une exposition à différents stress notamment pendant le processus de fabrication, de stockage et de transport. Parmi ces dégradations, l’agrégation, qui est fréquente, peut diminuer l’activité fonctionnelle de la protéine et générer des réponses immunes. Généralement, les premières étapes conduisant à la formation d'agrégats sont la dénaturation de la protéine et la formation de dimères. L'objectif de ma thèse était d'étudier la structure et la fonction des dimères formés à partir d'un anticorps thérapeutique spécifique, le roledumab. Plusieurs études réalisées sur différents mAbs ont révélé la présence de dimères covalents et non covalents ainsi que différents types d'association, en fonction des domaines impliqués dans cette dimérisation.Tout d'abord, les dimères présents en très faible quantité dans roledumab (<1%) ont été purifiés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Des analyses d'électrophorèse capillaire et de SDS-PAGE ont été réalisées dans des conditions non réductrices afin d’estimer la proportion de dimères liés de manière covalente et non covalente. Ces expériences ainsi que des analyses en LC-MS en conditions natives ont révélé pour la première fois la présence de trois formes de dimères, les complexes covalents etant associés par des ponts disulfures.La SEC couplée à la MS à haute résolution a été utilisée, par approche middle-up, pour déterminer les domaines impliqués dans la dimérisation. Les résultats ont révélé que les dimères de roledumab étaient associés par le domaine Fab pour former des complexes de type Fab-Fab. Par ailleurs, une analyse par cartographie peptidique réalisée dans des conditions non réductrices a révélé la présence d'un nouveau pont disulfure, Cys23LC-Cys96HC, spécifique des dimères du roledumab. Enfin, l'impact de cette dimérisation sur la fonctionnalité a été étudié par la mesure de l’affinité des dimères aux récepteurs FcγRIII et par des tests cellulaires spécifiques. Les résultats ont montré que les dimères avaient une affinité plus élevée pour les récepteurs FcγRIII et une activité également plus élevée par rapport aux monomères.