Μελέτη του μηχανισμού ρύθμισης της ρετρομετάθεσης

Τα σύνθετα ρετροτρανσποζόνια SVA (SINE-R, VNTR, Alu) αποτελούν την εξελικτικά νεότερη οικογένεια σύνθετων ρετρομεταθετών στοιχείων στο ανθρώπινο γένωμα. Απαντώνται σε ~2670 αντίγραφα και ενοχοποιούνται για την πρόκληση γενετικών ασθενειών (πχ. λευχαιμία, νευροϊνωμάτωση κλπ) με διάφορους μηχανισμούς. Έχει υποστηριχθεί ότι κινητοποιούνται από την πρωτεΐνη ORF2 των LINE-1 ωστόσο η μεταγραφική τους ρύθμιση παραμένει άγνωστη σε μεγάλο βαθμό.Στην παρούσα μελέτη ανακτήθηκαν, αρχικά, τα πλήρους μήκους SVA του ανθρώπινου γενώματος μέσω της βάσης δεδομένων UCSC. Έγινε κατηγοριοποίηση ανάλογα με τη γενωμική τους θέση και βρέθηκε ότι σχεδόν το σύνολο των SVA εδράζονται παρακείμενα στη θέση έναρξης της μεταγραφής ή εντός γονιδίων. Με στόχο την απομόνωση ενός ενεργού SVA, χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί εκκινητές και κλωνοποιήθηκαν μεταγραφήματα SVA από κύτταρα λευχαιμικού ασθενούς. Μέσω νουκλεοτιδικής σύγκρισης (BLAST-NCBI) αποδείχτηκε η ομολογία με ακολουθίες SVA οι οποίες και χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γένωμα. Χρησιμοποιώντας DNA από βλάστες ενός ασθενή με οξεία Β-λεμφοβλαστική λευχαιμία κλωνοποιήθηκε το SVA-C που εδράζεται στο 1ο ιντρόνιο του γονιδίου SMOC-1 (SVASMOC1-L). Ωστόσο αυτό χαρακτηρίστηκε από έλλειψη 347 νουκλεοτιδίων στην περιοχή VNTR σε σχέση με το αντίστοιχο SVA στο γονιδίωμα αναφοράς.Το SVASMOC1-L σημάνθηκε με ειδική κασέτα ανίχνευσης ρετρομετάθεσης που εξασφαλίζει την έκφραση της φθορισμογόνου πρωτεΐνης EGFP αποκλειστικά και μόνο, έπειτα από ένα γεγονός ρετρομετάθεσης (SVA/EGFP-INT). Μετά από διαμόλυνση και ανάλυση FACS σε κυτταρικούς κλώνους βρέθηκε ότι τα θετικά σε ρετρομετάθεση κύτταρα αποτελούσαν το 0.1-32% του συνόλου σε μαζικούς και μονήρεις κλώνους Α549, το 0.5-4.8% σε μαζικούς και μονήρεις κλώνους HeLa και το 4.7-6.3% σε μαζικούς κλώνους Η1299. Διαμόλυνση σε κύτταρα HUT-78 και Jurkat απέδωσε συχνότητες ρετρομετάθεσης 31.7- και 70.8%, αντίστοιχα. Τα γεγονότα ρετρομετάθεσης ανιχνεύθηκαν στις περισσότερες περιπτώσεις μέσω EGFP-θετικών κυττάρων με μικροσκοπία UV, τα οποία περαιτέρω πιστοποιήθηκαν ως γενωμικές ενσωματώσεις με ανάλυση PCR. Τα αυξημένα γεγονότα ρετρομετάθεσης συσχετίστηκαν σε κύτταρα Α549 με αλλαγή φαινοτύπου, φαινόμενα αυτοφαγίας, απόκτηση διηθητικότητας και ιδιοτήτων βλαστικών κυττάρων. Σε κύτταρα κλώνων Α549, βρέθηκε ότι το SVASMOC1-L μπορεί να κινητοποιηθεί από: α. την αντίστροφη μεταγραφάση ORF2 των LINE-1, β. αναστολείς των αποακετυλασών (Τριχοστατίνη-Α και βαλπροϊκό οξύ), γ. το αντικαρκινικό φάρμακο Ετοποσίδιο και δ. επαγόμενο οξειδωτικό στρες από υπεροξείδιο του υδρογόνου και αρσενικό.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν πειραματικά για πρώτη φορά ότι: 1. ένα VNTR-ελλειμματικό ρετροτρανσποζόνιο SVA είναι ρετρομεταθετικά ενεργό, 2. πολλαπλασιαστικά ενεργά κύτταρα, όπως τα καρκινικά, παρέχουν τις προϋποθέσεις για την τέλεση γεγονότων ρετρομετάθεσης και 3. ένα SVA με υψηλό δυναμικό ρετρομετάθεσης, μπορεί να συμβάλλει στην κακοήθη εξέλιξη της λευχαιμίας.