Uso do BLASTn na construção de primers

O estudo da genética vem evoluindo nas últimas décadas e uma das técnicas revolucionárias para o estudo do DNA foi a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Essa técnica consiste na replicação, em milhares de cópias, de um fragmento de DNA através das etapas de desnaturação, anelamento e extensão. Na etapa de desnaturação ocorre a separação entre as duas fitas de DNA para que, durante a fase de anelamento, os primers se liguem a essas fitas e permitam a ação da Taq polimerase em criar uma nova fita de DNA no decorrer da fase de extensão. Os primers são oligonucleotídeos curtos, em média com 20 nucleotídeos, que são construídos e utilizados em pares, em que um se liga na fita sense e outro na fita antisense do DNA, como mostra a Figura 1. São chamados também de iniciadores pois são eles que indicam para a enzima Taq polimerase onde iniciar a formação da nova fita de DNA e flanqueam a região alvo para que durante os ciclos da PCR somente essa região de interesse seja replicada. Sendo assim, a construção dos primers é de extrema importância e deve ser realizada com cuidado para que, durante a PCR, não ocorra a formação de dímeros ou ligações em regiões que não sejam a de interesse [1]. Nesse contexto, o uso de ferramentas de bioinformática para construção desses iniciadores é recomendado e amplamente utilizado, visando a diminuição de erros que possam acontecer durante o experimento. Desse modo, destaca-se aqui a utilização de uma ferramenta de bioinformática, entre outras como o Primer3 e o PrimerQuest, para que haja uma melhor construção de primers: o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). O BLAST pode ser utilizado tanto pela web, via servidor do NCBI (National Center for Biotechnology Information), quanto pode ser instalado localmente. Geralmente, os pesquisadores utilizam a versão web devido sua praticidade e rapidez ao enviar suas sequências para análise no servidor remoto do NCBI. O BLAST realiza a comparação entre sequências indicadas pelo pesquisador e sequências biológicas armazenadas em um banco de dados [2], sendo utilizado para se ter a certeza de que a sequência de nucleotídeos da região do seu interesse corresponde àquela encontrada no seu organismo de estudo. Para a PCR se usa o BLASTn, que pesquisa a sequência de nucleotídeos de interesse. Entre os benefícios em se utilizar o BLASTn é que essa ferramenta é executada no NCBI, uma instituição que apresenta um dos maiores bancos de dados de sequências genéticas, com atualizações regulares, além de oferecer uma interface amigável e apresentar fácil integração com outras ferramentas do NCBI. Nessa função, insere-se no programa a sequência, em formato FASTA, e se configura os parâmetros para a análise, como qual o organismo a ser estudado e qual o banco de dados escolhido para a busca. Caso a sequência indicada tenha similaridade com a sequência apontada no banco de dados, há a certeza de que aquela região do DNA corresponde com a real e a construção de primers pode ser iniciada efetivamente. Essa ferramenta é extremamente necessária para quem trabalha com polimorfismos, que são variações genéticas que aparecem como consequências de mutações, podendo ter diferentes classificações a depender da mutação original. Logo, é necessário conhecer quais as sequências de nucleotídeos antes e depois daquela mutação, para que haja a construção de primers que se liguem somente naquela região flanqueadora. O uso do BLAST é bem mais vasto do que o apresentado, podendo ser utilizado para pesquisar também sobre similaridades de aminoácidos e entre nucleotídeos e aminoácidos.