Microfluidique pour la mesure de bio-molecules secretees

Cette thèse porte sur l’étude et la quantification des molécules sécrétées par des cellules mammifères, organisées sous forme de sphéroïdes 3D dans des gouttes microfluidiques.Le sécrétome joue un rôle prépondérant dans la régulation des communications entre cellules eucaryotes, et contribue à la réponse collective des cellules de l’organisme. Caractériser la diversité des protéines sécrétées par des populations de cellules est ainsi une clé pour relier leur phénotype à leurs fonctions sécrétoires. Au cours des deux dernières décennies, des solutions technologiques ont ainsi permis de quantifier séparément le sécrétome de cellules non-adhérentes individuelles. Ces technologies, qui ouvrent la voie vers des mesures multiplexées de plusieurs molécules sécrétées par un très grand nombre de cellules, sont cependant difficiles à transposer dans le cas de cellules ayant besoin d’un substrat physique pour survivre.Dans ce manuscrit, on commence donc par présenter la plateforme microfluidique utilisée au cours de la thèse pour la culture de cellules adhérentes sous forme d’agrégats 3D particuliers, appelés sphéroïdes. Dans cette plateforme, nous développons un premier test immunologique type ELISA pour la quantification de la cytokine inflammatoire IL-1β, en utilisant des billes fonctionnalisées par des anticorps spécifiques à cette cytokine. L’utilisation combinée de la microscopie de fluorescence et de l’analyse informatisée des images permet de relier un signal optique lié au test immunologique à une grandeur biologique, ici la concentration de cytokine. Dans une goutte de 400µm, la vitesse de diffusion des molécules concurrence la cinétique chimique du test immunologique : une part importante de la réflexion se voit donc dédiée à l’étude, expérimentale et théorique, de la capture des cytokines sur le substrat du test ELISA en goutte.On applique ce test immunologique à la sécrétion de sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuses humaines hMSC. Ces cellules constituent une population hétérogène progénitrice de plusieurs types cellulaires, et démontrent une action trophique importante lorsqu’elles sont cultivées en 3D. Dans la plateforme microfluidique présentée, on mesure ainsi des sécrétions importantes d’IL-1β, mais aussi de la molécule-signal de l’angiogenèse VEGF. Un modèle numérique de réaction-diffusion permet de prédire les temps caractéristiques de capture par le test immunologique. En plus de mettre en évidence l’accumulation des molécules dans le temps, ce test révèle les effets d’un médicament non-stéroïdien sur la sécrétion de VEGF. Ces effets sur le sécrétome sont combinés à l’observation de la morphologie du sphéroïde, et à la mesure de sa production intracellulaire de VEGF.Les signaux associés à la production intra et extra-cellulaire présentent une large variabilité au sein d’un même répliqua biologique. Le dernier chapitre relie ces variabilités à celles de la population de cellules qui constituent nos sphéroïdes. Il semble exister un effet collectif à l’intérieur de l’agrégat qui dépasse la simple sommation des hétérogénéités cellulaires.