Développement de microtechnologies pour l'étude du guidage axonal

Le guidage axonal est un processus très important dans le développement du cerveau, permettant de lui donner sa structure et son organisation. La communauté scientifique des neurosciences lui porte un intérêt grandissant ces dernières années. Plusieurs outils appartenant au domaine des microtechnologies, que sont la microfluidique et le micropatterning, sont d’une aide importante pour étudier le guidage axonal in vitro. Ils permettent de confiner les neurones et leurs axones et de leur appliquer des gradients de molécules de guidage. Lors de ce travail de thèse, j’ai voulu développer un système pour étudier l’effet de gradients de molécules de guidage sur le guidage axonal. J’ai pour cela testé plusieurs configurations de dispositifs microfluidiques, de micromotifs (micropatterns) et de combinaisons de ces derniers.Nous avons d’abord utilisé deux approches pour isoler les axones de neurones dissociés de leurs somas afin de pouvoir étudier, à haut débit, l’effet de l’environnement moléculaire sur les cônes de croissance des neurones. La première approche consistait à faire pousser des neurones sur des motifs (patterns) de différentes protéines. Elle a permis de montrer leur capacité d’adhésion spécifique sur ces motifs. La seconde consistait à ensemencer des neurones dans un dispositif microfluidique dans lequel, lors de leur pousse, les axones sont séparés des somas par des microcanaux. Nous avons ensuite étudié l’effet, sur les axones, de gradients de molécules de guidage. Pour commencer, nous avons mesuré l’effet de deux molécules de guidage : l’éphrine et la sémaphorine, en cultivant des neurones en présence de gradients patternés de ces deux molécules. Par la suite, nous avons étudié un autre modèle où les neurones sont plus proches de leur environnement in vivo, des explants poussant sur des motifs de laminine contenant un gradient. Pour aider au positionnement de l’explant, nous avons polymérisé des hydrogels. Ensuite, nous avons mis des explants à côté de gradients patternés d’éphrine. Enfin, nous avons cherché à obtenir un gradient soluble de molécules de guidage entretenu sur des temps longs, plus proche des gradients existant in vivo. Dans ce but, nous avons voulu fabriquer un dispositif microfluidique permettant d’appliquer un gradient soluble de molécules de guidage sur des neurones. Pour obtenir un gradient stable dans le temps, nous avons aussi cultivé des neurones à côté de cellules exprimant la nétrine, une autre molécule de guidage. Pour finir, nous avons cultivé des neurones et des glies dissociés pour étudier leurs interactions.L’ensemble de ces recherches n’a pas permis d’obtenir un dispositif fiable pour étudier l’effet de molécules sur la pousse et le guidage des axones. Néanmoins, la configuration consistant en une coculture de neurones à proximité de cellules relargant de la nétrine nous a permis d’obtenir des premiers résultats encourageants. Nous avons ainsi mis au point un ensemble de méthodes qui pourront nous permettre de finaliser le développement d’un système pour étudier le guidage axonal, fonctionnel et efficace.