Modificaciones de histonas: funciones durante la simbiosis fijadora de nitrógeno

Las leguminosas se asocian con bacterias del suelo del género Rhizobium en condiciones de baja disponibilidad de nitrógeno en el suelo. Estas bacterias denominadas colectivamente como rizobios convierten el nitrógeno atmosférico en formas reducidas que pueden ser asimilables por las plantas en un proceso conocido como fijación biológica de nitrógeno (FBN). En este proceso la planta forma un nuevo órgano, el nódulo, donde residen las bacterias y se produce la FBN. La formación de nódulos va acompañada de profundos cambios en la expresión génica en las células de la raíz involucradas en simbiosis. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que los cambios traduccionales de los mRNAs contribuyen a esta reprogramación de la expresión génica en la simbiosis entre la leguminosa Medicago truncatula y el rizobio Sinorhizobium meliloti. Una de las categorías funcionales sobrerrepresentadas entre los genes regulados diferencialmente a nivel traduccional incluía genes involucrados en metilación del DNA, modificación post-traduccional de histonas y remodeladores de la cromatina, entre ellos genes que codifican una demetilasa de lisinas de histona (MtPKDM9B) y una histona acetiltransferasa (MtHAC3). Ambas proteínas están involucradas en las modificaciones postraduccionales de histonas y podrían cumplir funciones en la remodelación de la cromatina, y por lo tanto en la expresión génica, durante la simbiosis fijadora de nitrógeno. MtPKDM9B se expresa ubicuamente en diferentes órganos de M. truncatula, sin embrago se acumula a mayores niveles en raíces crecidas en ausencia de nitrógeno y en nódulos respecto de raíces crecidas en presencia de nitrógeno y otros órganos foliares. El transcripto MtPKDM9B está sujeto a splicing alternativo generando dos variantes alternativas, una larga que codifica la proteína funcional y aumenta su asociación a la maquinaria traduccional en presencia de rizobios, y una más corta, que saltea el exón 3, introduciendo un codón de terminación prematuro. El silenciamiento de ambas variantes de MtPKDM9B mediante RNA de interferencia (RNAi) produjo una disminución en la densidad de los eventos de infección producidos por rizobios y nódulos más pequeños que contiene bacterias muertas en su interior en comparación con las raíces que fueron transformadas con una construcción control GUS RNAi. Por otro lado, el silenciamiento específico de la variante larga mediante la expresión de un microRNA artificial, además de afectar la infección bacteriana, también afectó el número de nódulos y la supervivencia de las bacterias dentro de los nódulos. El silenciamiento de ambas variantes de MtPKDM9B, o específicamente de la variante larga, produjo alteraciones en la arquitectura de raíz, evidenciada por una mayor longitud de la raíz principal (RP) y mayor densidad de raíces laterales (RLs). Utilizando la técnica de inmunoprecipitación de la cromatina seguida de secuenciación masiva (ChIP-seq) en raíces MtPKDM9B RNAi o GUS RNAi a las 48 hs pos-inoculación con S. meliloti o con agua como control, se encontraron regiones que cambian el patrón de trimetilación en la lisina 27 de histona 3 (H3K27me3) debido tanto al silenciamiento de MtPKDM9B como a la respuesta frente a la inoculación con S. meliloti. Entre los loci afectados se encuentran genes esenciales para la infección bacteriana tales como MtNPL (Nodule Pectate Lyase), el cual codifica la pectina liasa de nódulo y MtNSP1 (Nodulation Signaling Pathway 1), el cual codifica un factor de transcripción especifico de plantas de la familia GRAS. También se encontraron genes que participan en el desarrollo de la RP y de órganos laterales de la raíz tales como MtLBD16 (Lateral Organ Boundaries Domain 16), el cual codifica un factor de transcripción de la familia LBD que modula el desarrollo de nódulos y RLs, y MtSTY (SHORT INTERNODES/STYLISH 1), el cual codifica un factor de transcripción que regula genes de la vía de biosíntesis de auxinas modulando la formación y desarrollo de órganos laterales de la raíz. En una segunda etapa, se abordó la caracterización de la expresión y función del gen que codifica la histona acetiltransferasa MtHAC3. Cabe destacar que la expresión de MtHAC3 es co-regulada con la de MtPKDM9B en distintos órganos y condiciones ambientales. A su vez, los transcriptos MtHAC3 se acumulan en la región meristemática de los nódulos, sugiriendo que podría participar en el control de las divisiones celulares requeridas para el desarrollo del nódulo. Utilizando una estrategia de RNAi, se observó que las raíces silenciadas en MtHAC3 mostraron un menor número de eventos de infección, pero un mayor número de nódulos respecto de las raíces GUS RNAi, indicando que esta proteína también estaría involucrada en la infección bacteriana y en la formación de nódulos en la simbiosis entre M. truncatula y S. meliloti. Estos resultados contribuyen a una mejor comprensión de cómo los cambios en las marcas epigenéticas, en particular la metilación y acetilación de H3, afectarían la reprogramación de la expresión génica durante la FBN.