Ανάπτυξη μικροδιατάξεων (chips) για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων

Η ανάπτυξη μικροδιατάξεων (chips) για χημική ανάλυση αποτελεί ένα νέο και ταχύτατα εξελισσόμενο πεδίο με πληθώρα εφαρμογών στη Χημεία και τη Βιολογία. Η κατασκευή των αναλυτικών μικροσυστημάτων βασίζεται σε φωτολιθογραφικές τεχνικές παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται στη μικροηλεκτρονική για την παραγωγή ολοκληρωμένων κυκλωμάτων. Στο Κεφάλαιο 1 (Εισαγωγή) της παρούσας διατριβής περιγράφονται, συνοπτικά, η αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) και της αντίστροφης μεταγραφής-PCR (RT-PCR), οι παράγοντες που επιδρούν στην εξειδίκευση και την απόδοση της αντίδρασης και τα όργανα που χρησιμοποιούνται για θερμική κυκλοποίηση. Περιγράφονται επίσης διάφορες μέθοδοι ανάλυσης προϊόντων PCR. Στη συνέχεια συζητούνται μικροσυστήματα για εκτέλεση PCR. Ακολουθεί η περιγραφή της αρχής της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές (CE) και οι εφαρμογές των κλασσικών συστημάτων CE και των μικροσυστημάτων CE στην ανάλυση DNA. Το Κεφάλαιο 2 της διατριβής περιγράφει τη σχεδίαση, κατασκευή και μελέτη υάλινης μονολιθικής μικροσυσκευής (chip) συνεχούς ροής για τη λειτουργική σύζευξη της αντίστροφης μεταγραφής (RT) και της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Το chip εκτελεί ταχύ πολλαπλασιασμό DNA και RNA και επιτρέπει την επιλογή αριθμού κύκλων και όγκου δείγματος. Η συσκευή περιλαμβάνει δίκτυο μικροκαναλιών, το οποίο ορίζει 4 διακριτές ζώνες με προκαθωρισμένες θερμοκρασίες. Κατά τη διέλευση του δείγματος και των αντιδραστηρίων, στη μία ζώνη εκτελείται η RT και στις υπόλοιπες πραγματοποιείται η PCR (αποδιάταξη DNA, δέσμευση εκκινητών και πολυμερισμός). Λόγω της υψηλής τιμής του λόγου επιφάνεια/όγκος η μεταφορά θερμότητας είναι ταχεία, γεγονός το οποίο καθιστά εφικτή τη συλλογή προϊόντων PCR σε 6 min μετά από 30 κύκλους της αντίδρασης. Επίσης επιτεύχθηκε ταυτόχρονος πολλαπλασιασμός νουκλεϊκών οξέων διαφόρων δειγμάτων σε συνεχή ροή. Το Κεφάλαιο 3 περιλαμβάνει την ανάπτυξη ανιχνευτή φθορισμού επαγώμενου με λέιζερ (LIF) για τον ταχύ (σε δευτερόλεπτα) προσδιορισμό των προϊόντων πολλαπλασιασμού DNA και RNA που λαμβάνονται απο τη μικροσυσκευή PCR/RT-PCR συνεχούς ροής. Μέχρι σήμερα, η ανάλυση των προϊόντων PCR/RT-PCR απο μικροσυστήματα συνεχούς ροής γινόταν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Συνεπώς η ταχεία διαδικασία πολλαπλασιασμού, που επιτυγχάνεται με το chip, ακολουθείται από ένα χρονοβόρο στάδιο ανάλυσης των προϊόντων. To προτεινόμενο σύστημα LIF υπερέχει σε ανιχνευσιμότητα και ταχύτητα προσδιορισμού και παρέχει τη δυνατότητα αυτοματοποίησης. Τα προϊόντα πολλαπλασιαμού DNA ή RNA μετά την έξοδό τους από το chip αναμιγνύονται με διάλυμα της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green I και στη συνέχεια εισάγονται στον ανιχνευτή για μέτρηση. Η ένταση του φθορισμού είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του DNA. Το Κεφάλαιο 4 περιλαμβάνει την ανάπτυξη υάλινης μικροδιάταξης (chip) για τον ταχύ διαχωρισμό μορίων DNA με ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές και ταυτόχρονη ανίχνευσή τους με σύστημα φθορισμού επαγώμενου με λέιζερ. Το προτεινόμενο σύστημα εφαρμόζεται στην ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών, χρησιμοποιώντας τη σόγια ως μοντέλο. Για την παρασκευή του chip ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές κατασκευάστηκε φωτομάσκα από πολυμερές υλικό αντί των πλακών χρωμίου οι οποίες έχουν υψηλό κόστος. Επιτεύχθηκε διαχωρισμός και ανίχνευση των προϊόντων PCR σε χρόνο 60 δευτερολέπτων.