Edição de genes de resistência dominante e recessiva contra begomovirus

Begomovirus constitui o maior gênero da família Geminiviridae, uma das maiores famílias de vírus de plantas, cujas espécies infectam diversas monocotiledôneas e dicotiledôneas cultiváveis e representam severa limitações à produtividade agrícola mundialmente. Esse amplo espectro de gama de hospedeiros resulta de estratégias sofisticadas desenvolvidas por geminivírus para superar o arsenal de defesas antivirais em espécies de plantas tão diversas. Portanto, torna-se necessário o desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de resistência a begomovírus. Nesta investigação, foram exploradas tanto estratégias para manipulação de resistência dominante quanto silenciamento de genes de resistência recessiva na planta modelo Arabidopsis thaliana. Para garantir resistência dominante, foi utilizado o gene NIK1 [Nuclear shuttle protein (NSP)-interacting kinase 1] que protege plantas contra begomovírus em interações incompatíveis, mas cuja resistência é superada pela proteína de geminivírus NSP em hospedeiros suscetíveis. Plantas Columbia (Col-0) e nocaute nik1-1 foram transformadas com o mutante simples NIK1-T469A e duplo NIK1-T474D/T469A sob o controle do promotor 35S. As plantas transformadas foram confirmadas por PCR, obtendo-se cinco linhagens expressando o duplo mutante e duas linhagens, o mutante simples. Com inserção única do gene e em homozigose, as plantas Col-0 transformadas exibiram alta expressão dos transgenes, e os mutantes complementados com o duplo mutante, exibiram baixa expressão do transgene. Foi observado que a expressão dos mutantes NIK1-T469A e NIK1-T474D/T469A reprimiram acentuadamente a expressão dos genes marcadores da via de imunidade antiviral mediada por NIK1, RPL28, S25, PSII e FD1. Consistente com esses resultados, as plantas superexpressando NIK1-T469A e NIK1-T474D/T469A apresentam menor comprimento da raiz. Todas as plantas mutantes demonstraram baixo acúmulo viral, e baixos sintomas da infecção por CabLCV, comparados com as plantas Col-0, nik-1 e NIK1-8 (uma linhagem complementando o gene NIK1 intacto). Estes resultados indicam que os mutantes NIK1-T469A e NIK1-T469A/T474D são constitutivamente ativados e conferem resistência contra geminívírus em Arabidopsis. No caso de resistência recessiva, inicialmente foi confirmado o carater recessivo do gene NIG. Para isso, foi demonstrado que plantas nig-1 submetidos à infecção por begomovírus acumularam menor carga viral e exibiram sintomas atenuados quando comparadas com Col-0. Além disso, foi examinado o efeito do silenciamento dos genes de suscetibilidade NIG e NISP no desenvolvimento de Arabidopsis. Inativação de NIG ou NISP não causou efeitos adversos no desenvolvimento e crescimento das linhagens silenciadas nig-1 ou nisp-1 comparados com Col-0. Para obter resistência recessiva mais eficaz, foi utilizado a tecnologia CRISPR/Cas para o duplo silenciamento dos genes NIG e NISP. Foi inicialmente construído o cassete contendo os RNAs guias de NISP e então inserido no vetor de transformação de plantas contendo o gene Cas pela técnica de Golden Gate. As plantas nocautes nig-1 foram transformadas com o vetor do CRISPR/Cas nisp-pHEE-401E, e as plantas selecionadas fora confirmadas por PCR. Foi possível confirmar plantas editadas em apenas um alelo do gene de NISP, demonstrando a funcionabilidade dessa técnica. Experimentos estão em progresso para selecionar os mutantes duplos nisp/nig em homozigose e avaliar o efeito do silenciamento duplo dos genes recessivos na resistência contra begomovírus. Palavras-chave: Geminiviridae. Begomovirus. NIK1. Resistencia dominante. NIG. NISP. Resistência recessiva. Arabidopsis. CRISPR/CAS. Duplo mutante. Duplo nocaute.