Novel strategies for the identification and full genomic characterization of unknown HPV types from human DNA samples

Nouvelles stratégies pour l'identification et la caractérisation génomique complète de types inconnus d'HPV à partir d'échantillons d'ADN humain Les papillomavirus humains (HPV) sont de petits virus icosaédriques non-enveloppés à ADN circulaire double brin. À ce jour, plus de 200 HPV ont été identifiés. La classification des Papillomaviridae est basée sur les identités de séquence nucléotidique du gène L1. La découverte de nouveaux HPV est d'une importance cruciale pour élargir nos connaissances sur ces virus. Alors qu'un sous-groupe HPV du genre alpha communément appelé "à haut risque", a été clairement associé aux cancers anogénitaux, et à certains cancers de la tête et du cou, il existe peu d’informations sur le rôle des HPV des genres bêta et gamma-HPVs dans les cancers humains. Des études récentes montrent que des bêta-HPVs pourraient jouer un rôle dans les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC), en association avec le rayonnement ultraviolet (UV). Toutefois, des études supplémentaires sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse chez l’homme. Jusqu’à présent, les méthodes de choix utilisées pour l'identification de nouveaux HPVs dans des échantillons humains reposaient sur l’utilisation de la PCR et le séquençage de Sanger. Plusieurs amorces spécifiques ou à large spectre ciblant le gène L1, ont été développées pour l'amplification de séquences de HPV. De nos jours, avec l'avènement des méthodes de séquençage à haut débit (NGS), la possibilité d’élargir ces familles virales s’est accrue. Cependant, de grandes quantités de données sont générées par ces nouvelles méthodes de séquençage nécessitant le développement de méthodes bioinformatiques d'analyse spécifiques pour une identification et une reconstruction efficaces des séquences virales. Le but de ce travail de thèse a été de développer une stratégie pour l'identification des HPV, ainsi que la caractérisation du génome complet de nouveaux types, dans des échantillons humains. Au cours de ce travail de thèse, l’utilisation d’amorces à large spectre connues et validées, mais aussi l’utilisation d’amorces améliorées par notre laboratoire, toutes ciblant une portion du gène L1, ont été utilisées pour la recherche de séquences HPV dans des échantillons cutanés et oraux. L'analyse des données NGS a permis l'identification de 105 possible nouvelles séquences de PVs, ainsi que l’identification de 296 HPV connus. Une méthode d’analyse bioinformatique a été développée pour l’analyse des données de séquençage. La deuxième partie de ma thèse a consisté, à partir des données NGS précédemment obtenues, d’obtenir le génome entier de plusieurs HPVs. Ainsi, le génome entier de HPV227, un nouveau bêta-HPV, a été obtenu, en combinant plusieurs méthodes c.à.d. l'amplification par cercle roulant (ou rolling circle amplification - RCA), PCR pour amplification de longs fragments (ou “Long Range PCR”), le séquençage de Sanger par “primer walking”, et le clonage. Enfin, la technologie de séquençage par nanopores (MinION, Oxford Nanopore Technologies) a été utilisée afin d’obtenir le génome entier du HPV227, directement à partir de l'échantillon cutané d'origine et ainsi permettre un gain de temps important dans la caractérisation du génome complet des HPV. Pour ce faire, une méthode d’analyse bioinformatique des données de séquençage MinION pour la reconstruction des génomes de HPV a été développée. L'ensemble du génome du HPV227 a été reconstruit, confirmant l'efficacité de cette stratégie. Dans l'ensemble, cette thèse décrit et valide plusieurs approches pour l'identification et la caractérisation complète de nouveaux génomes de HPV. De plus, la découverte de 105 possible nouveaux PVs élargit nos connaissances sur cette famille de virus, bien que pour des analyses supplémentaires soient nécessaires pour la caractérisation complète de ces nouveaux virus