Rôle de la kinase ARAF dans le mélanome cutané muté NRAS

Les gènes NRAS et BRAF, impliqués dans la voie de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK, sont fréquemment mutés dans le mélanome cutané. Des inhibiteurs spécifiques de BRAF sont utilisés en clinique mais uniquement chez les patients porteurs de mutations BRAF du fait de l’activation paradoxale de la voie ERK en réponse à ces molécules dans un contexte muté NRAS. Notre laboratoire a développé des modèles murins reposant sur l’inactivation conditionnelle des gènes BRAF et CRAF qui permettent l’étude du rôle de ces kinases dans les mélanomes mutés NRAS. Nous montrons que les cellules de mélanome mutées NRAS peuvent échapper à la perte concomitante de BRAF et CRAF via ARAF, qui peut soutenir l’activation de ERK et la survie de ces cellules (appelées ARAF only). De plus, les cellules ARAF only montrent une activation paradoxale de la voie ERK en réponse à un inhibiteur de BRAF, démontrant le rôle de ARAF dans ce mécanisme. Par ailleurs, des analyses in silico menées au laboratoire ont montré que ARAF est muté dans de rares cas de mélanome cutané. En particulier, la mutation ARAFS214F impliquant un résidu connu pour être un site d’ancrage des protéines 14-3-3 etcoexistant avec des mutations activatrices de NRAS a attiré notre attention. Les objectifs de mon projet de thèse sont : de mieux comprendre le rôle de ARAF dans le mélanome cutané induit par NRAS et d’autre part de caractériser le mutant ARAF S214F dans le contexte du mélanome. Dans un premier temps, j’ai recherché de nouveaux partenaires de ARAF par analyse protéomique. Après sélection d’une centaine de partenaires potentiels par crible fonctionnel par ARNi, j’ai identifié le facteur de transcription MITF. MITF joue un rôle clé dans le mélanome : son niveau d’activité est lié au phénotype souche ou prolifératif des cellules tumorales. Un lien entre la voie ERK et MITF a déjà été décrit : le résidu S73 de MITF est phosphorylé directement par ERK conduisant à la fois à la modulation de l’activité transcriptionnelle de MITF, son export nucléaire et à sa dégradation par le protéasome. Toutefois, aucune interaction entre une kinase RAF et MITF n’a été décrite à ce jour. Après avoir validé l’interaction ARAF/MITF par coimmunoprécipitation et par Proximity Ligation Assay, j’ai mis en évidence la présence de complexes ARAF/MITF dans le cytoplasme des cellules ARAF only. En utilisant des protéines recombinantes, je montre que cette interaction est directe. De plus, MITF peut interagir avec les autres kinases de la famille RAF : BRAF et CRAF. De façon intéressante, alors que le mutant kinase-dead de BRAF interagit très faiblement avec MITF, la forme mutée BRAFV600E interagit fortement avec MITF suggérant l’importance de l’activité kinase de BRAF dans cette interaction. Au niveau fonctionnel, cette interaction RAF/MITF induit une relocalisation cytoplasmique de MITF et est associée à une diminution de l’activité transcriptionnelle de MITF. Ce travail dévoile donc un nouveau niveau de régulation de l’activité de MITF par interaction directe avec les protéines RAF.Dans le second axe de mon projet de thèse, j’ai démontré l’effet activateur de la mutation ARAFS214F sur la voie ERK dans des mélanocytes et des cellules de mélanome. En outre, cet effet activateur de la mutation ARAFS214F dépend de la présence de mutations activatrices de NRAS, dans les deux modèles de mélanomes humains utilisés. Ces résultats révèlent que les mutations du résidu S214 ARAF ont une importance fonctionnelle dans les cellules tumorales, renforçant l’intérêt d’étudier ARAF.