Automation of AFM measurements for biological applications

Automatisation des mesures AFM pour des applications en biologie Ces dernières années, le phénotype mécanique des cellules (tel que l'adhésion, l'élasticité, la rigidité), également connu sous le nom de propriétés mécaniques, s'est avéré être un identifiant valable pour distinguer les cellules saines des cellules malades. Les chercheurs du monde entier ont établi un phénotype mécanique lié au cancer, aux maladies cardiovasculaires et aux maladies du sang, entre autres. La microscopie à force atomique (AFM) est la technique la plus utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques et permet d'obtenir les propriétés à l'échelle nanométrique. Cependant, la manipulation de l'AFM requiert des compétences techniques élevées et n'a pas été conçue pour les échantillons biologiques. Cependant, la possibilité d'analyser des échantillons dans l'air ou dans un liquide ces dernières années la rend plus attrayante pour le domaine du vivant. Cependant, avec les AFM actuels, il n'est pas évident d'analyser un nombre élevé de cellules ou de population cellulaire et il est ensuite difficile d'obtenir des résultats statistiques. Cette thèse de doctorat vise à résoudre le problème du faible débit, une méthodologie automatisée est proposée pour y parvenir. Cette méthodologie est basée sur la combinaison de deux techniques : des réseaux de cellules et l'automatisation de l'AFM. Les mesures mécaniques sont effectuées automatiquement en exécutant un script développé en Jython et les cellules sont immobilisées dans des positions connues permettant ainsi un plus grand nombre de mesures par rapport à ce qui a été démontré jusqu'ici dans la littérature. Premièrement, l'immobilisation est effectuée pour les microbes dans des timbres PDMS microfabriqués et les cellules de mammifères dans des réseaux de cellules commerciales (BIOSOFT et CYTOO). L'immobilisation est effectuée, dans le cas des microbes, en utilisant une technique d'assemblage convectif/capillaire atteignant un taux de remplissage d'environ 85 %. Et pour les cellules de mammifères, la technique utilisée consiste à fixer la cellule sur une surface préalablement fonctionnalisée. Ensuite, l'AFM a été modifié pour effectuer les mesures automatiquement. L'automatisation a été réalisée par le développement d'un script écrit en Jython et exécuté directement dans un BioAFM commercial (JPK Allemagne). Le script est polyvalent et peut être adapté à plusieurs configurations d'échantillons. Le script exécute un petit nombre d'indentations (9 ou 16) sur l'échantillon, en acquérant des courbes de force de différentes régions des cellules et en réduisant en même temps le temps passé sur chaque cellule. Les résultats ont démontré que l'augmentation du nombre de cellules a un impact sur le nombre de mesures effectuées sur les cellules, et il est toujours possible d'obtenir des résultats comparables à ceux rapportés dans la littérature. Pour la première fois, l'analyse de la rigidité sur ~900 cellules de levure (C. albicans) est rapportée et met en évidence la présence de deux sous-populations. Nous avons comparé des cellules de levure natives avec des cellules de levure traitées à la caspofongine. Les résultats ont été obtenus en 4 h avec 9 indentations par cellule. Pour les cellules HeLa, la comparaison a été faite entre les cellules HeLa natives et les cellules HeLa fixées. 80 cellules ont pu être analysées en 30 minutes.