Identification of interactions between proteins and excipients to elucidate solution properties and stabilization processes in high concentration biotherapeutics formulations

Identification des interactions entre les protéines et les excipients afin d'élucider les propriétés de la solution et les processus de stabilisation dans les formulations biothérapeutiques à haute concentration Les formulations d'anticorps monoclonaux (mAb) à haute concentration sont essentielles pour l'administration sous-cutanée, car elles permettent d'administrer une forte dose thérapeutique dans de faibles volumes. Toutefois, à des concentrations supérieures à 100 mg/mL, les mAb ont tendance à s'auto-associer de façon réversible en oligomères transitoires, entraînant une forte augmentation de la viscosité. Cela complique la fabrication, la manipulation et l'injection du traitement et peut en compromettre la stabilité et l'efficacité. Pour limiter ces effets, des excipients, typiquement des acides aminés, des sucres ou des tensioactifs, sont ajoutés. Ils permettent de réduire les interactions protéine-protéine et d'assurer la stabilité du mAb. Cependant, leur sélection reste largement empirique, car leur impact sur l'auto-association et la viscosité demeure mal élucidé. Au cours de cette étude, une IgG évaluée lors d'essais cliniques par Sanofi a été utilisée comme modèle. Un ensemble de méthodes RMN complémentaires a été optimisé dans le but de détecter les interactions mAb :mAb et mAb :excipients dans des conditions standard de formulation. Ces méthodes incluent une analyse des signaux ¹H du mAb en présence de neuf excipients différents, des expériences à gradient de champ pulsé (PFG-RMN), une analyse des perturbations de déplacement chimique (CSP), des expériences de transfert de saturation (STD-RMN) et des mesures de relaxation transverse (R2). De manière complémentaire, la viscosité macroscopique des échantillons a été mesurée par rhéométrie, et la distribution en taille des oligomères de mAb a été analysée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Cette analyse s'est avérée complexifiée par les échanges entre monomères et clusters, confirmant la faible capacité de la DLS à décrire la distribution des espèces de mAb à haute concentration. De plus, les paramètres d'interaction déduits des analyses à faible concentration (kD) n'ont pas permis de prédire la viscosité à haute concentration. Cependant, les analyses par RMN ont permis de relier la viscosité macroscopique mesurée par rhéométrie avec les interactions moléculaires du mAb. Les intensités RMN 1D ¹H se sont révélées très sensibles à l'oligomérisation réversible du mAb. Après correction par la viscosité (mesurée par rhéométrie), une forte perte de signal RMN a été observée au-delà de 50 mg/mL, ce qui indique la formation d'oligomères transitoires (ou clusters). Parmi les neuf excipients testés, l'arginine et la lysine réduisent de manière significative la perte de signal RMN, et donc l'oligomérisation réversible du mAb. La majorité des excipients permettent de diminuer la viscosité macroscopique, les plus efficaces étant là encore l'arginine et la lysine. L'analyse R2 et les CSP ont montré que l'arginine, la lysine et le sucrose interagissent le plus fortement avec la surface du mAb, tandis que la glycine et les surfactants montrent des interactions plus faibles, essentiellement détectées en présence de clusters. Les STD-RMN se sont révélées particulièrement sensibles à l'état oligomérique du mAb et ont détecté de fortes interactions avec la lysine, tandis que les mesures en présence de proline ont montré une faible reproductibilité. Globalement, ce travail montre que la RMN est adaptée à l'étude des interactions faibles dans des solutions concentrées de mAb. Les données indiquent que la viscosité dépend non seulement du degré d'auto-association du mAb, mais aussi de la nature des interactions transitoires entre les différents clusters. Les interactions mAb-excipients peuvent contribuer à la régulation du réseau d'interactions formé par le mAb, mais ne peuvent à elles seules déterminer la viscosité macroscopique. La description mécanistique de l'auto-assemblage du mAb et du rôle des excipients par la RMN contribue à rationaliser les déterminants moléculaires de la viscosité.