Impact de la composition du ribosome sur la fidélité de la traduction

Les ribosomes, acteurs principaux de la synthèse protéique, sont constitués de protéines et d’ARNs. Ces dernières années la notion de "ribosome spécialisé" est apparue. Cela implique que les ribosomes sont hétérogènes dans leur composition protéique et les modifications chimiques des ARNr. Ces différentes populations de ribosome présenteraient des spécificités de traduction différentes. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à une modification chimique des ARNr particulière, les 2’-O-méthylations des riboses, à leur variabilité et à leur rôle dans la fidélité et la régulation de la traduction.Pour réaliser cette étude, un modèle de cellules HeLa a été créé dans lequel la synthèse de la fibrillarine, la méthyltransférase responsable des 2’-O-méthylations, est inhibée par un shRNA (small hairpin RNA) intégré de façon stable dans le génome. L’étude de l’impact de la baisse de la fibrillarine sur les 2’-O-méthylations a permis de montrer que la diminution des méthylations des ARNr est globale mais varie selon la position. Ainsi, certaines positions sont plus sensibles que d’autres à la baisse du taux de fibrillarine.J’ai tout d’abord étudié les effets de la baisse de la méthylation des ARNr sur la traduction globale, par la technique de ribosome profiling. Cette technique est fondée sur le séquençage à haut débit des fragments d’ARNm protégés par les ribosomes. J’ai ainsi pu montrer que 43 gènes candidats étaient différentiellement traduits en condition d’hypométhylation des ARNr. A partir de cette liste j’ai cherché des éléments fonctionnels et/ou moléculaires communs à plusieurs gènes candidats. J’ai par la suite montré que les taux de translecture et de décalage de cadre de lecture augmentaient quand les ARNr sont hypométhylés. La baisse de la méthylation des ARNr entraîne donc une baisse de la fidélité de la traduction.Des études précédentes ont montré que l’initiation IRES-dépendante était impactée par la baisse des méthylations des ARNr. J’ai donc réalisé une étude globale sur l’initiation de la traduction en adaptant la technique de ribosome profiling de façon à identifier spécifiquement les ribosomes en cours d'initiation. J’ai ainsi révélé que 66 sites d’initiation étaient impactés par la baisse de la méthylation des ARNr.Nous avons localisé les positions méthylées les plus impactées sur la structure 3D du ribosome. Ceci nous a permis de regrouper les modifications par région. Nous nous sommes intéressés à un groupe de méthylations conservées entre la levure et l’homme et situées au niveau du tunnel de sortie du peptide. J’ai délété chez S. cerevisiae les snoARNs responsables de ces méthylations. J’ai ensuite cherché à démontrer si la perte de ces méthylations avait un impact sur la croissance cellulaire et la sensibilité à différents antibiotiques. J'ai aussi effectué des mesures de translecture et de décalage de cadre de lecture. L’ensemble de mes résultats a montré que la délétion conjointe de trois des quatre snoARNs impliqués dans les méthylations autour du tunnel de sortie du polypeptide n'a pas d'effet sur la fidélité de la traduction.Au cours de cette étude chez la levure, j’ai révélé un effet inédit de la délétion du gène ASC1 sur la translecture des codons stop. Asc1p est une protéine plateforme associée au ribosome, dont l’absence entraîne une diminution de la translecture du codon stop. Les mécanismes moléculaires impliqués demeurent actuellement inconnus.Au cours de ma thèse, j’ai pu montrer par des approches globales et spécifiques que la baisse de la méthylation des ARNr entraînait des variations spécifiques de l’expression protéique ainsi qu’une diminution spécifique de la fidélité de la traduction. Les mécanismes moléculaires impliquées sont toujours activement recherchés.