Bases moleculares del tránsito de hierro en la fijación biológica del nitrógeno

One of the most important processes for obtaining assimilable nitrogen in natural ecosystems is mediated by nitrogenase. This metalloenzyme requires three different iron-sulfur clusters for N2 reduction to NH3, a process known as nitrogen fixation. Assembly and formation of these metallic cofactors has been studied in detail on the bacterium Azotobacter vinelandii. These studies indicate that the proteins NifQ, NifU and NifS are the starting point for the incorporation of molybdenum, iron and sulfur into nitrogenase clusters. NifQ receives a 4Fe-4S precursor through direct interaction with NifU to form a 3Fe-4S-Mo group. NifU acts as central point for assembly of iron-sulfur clusters that will be delivered to apo-proteins. In this pathway sulfur is provided by the cysteine desulfurase NifS, but the iron donor is unknown. In addition to NifU, IscU also acts as a scaffold protein in the formation of Fe-S clusters as house-keeping system. At the beginning of this Doctoral Thesis, it was unknown whether IscU would have some role in Fe-S cluster delivery to NifQ. It has been shown that although IscU and NifQ interact, NifU is the principal iron donor to NifQ. In A. vinelandii there are two known points of interest in iron homeostasis regarding from nitrogen fixation: bacterioferritin A (BfrA), a cytosolic iron storage protein, and NifU. With the aim of finding new proteins involved in iron trafficking, a pull-down was done using these two proteins as bait and an extract of A. vinelandii DJ. Among the interactors found, glutaredoxin D (GrxD) was a promising candidate as it interacts with both proteins. Different copurification assays confirmed that GrxD only interacts with BfrA when BfrA is iron loaded and GrxD is missing its sulfoferric cluster. It indicates a possible iron transfer from BfrA to GrxD. On the other hand, NifU-GrxD interaction occurs independently of metallic state of these proteins although this interaction was stronger when only one of them was Fe-S reconstituted. Finally, grxD and bfrA mutants fix, significantly, less nitrogen than the wild-type strain. All these data suggest that GrxD is required for optimal nitrogenase activity, participating in iron metabolism. RESUMEN Uno de los procesos más importantes para la obtención de nitrógeno asimilable en los ecosistemas naturales es la fijación de nitrógeno catalizada por la nitrogenasa. Esta metaloenzima posee tres grupos sulfoférricos que son necesarios para que se produzca la reducción de N2 a NH3. El ensamblaje y formación de los cofactores metálicos de la nitrogenasa han sido descritos en detalle en la bacteria Azotobacter vinelandii. Estos estudios posicionan a las proteínas NifQ, NifU y NifS como punto de partida para la incorporación de molibdeno, hierro y azufre respectivamente. NifQ recibe un precursor 4Fe-4S, por interacción directa, de NifU para formar su grupo 3Fe-4S-Mo. NifU actúa como eje central en el ensamblaje de los grupos sulfoférricos que serán entregados a apo-proteínas, donde el azufre es entregado por la desulfurasa NifS y el donador de hierro es desconocido. Además de NifU, la proteína IscU también actúa como proteína andamio en la formación de los grupos Fe-S actuando como un sistema house-keeping. Al inicio de esta Tesis Doctoral se desconocía si IscU tenía alguna implicación en la entrega de grupos Fe-S a NifQ. Se ha comprobado que, aunque IscU y NifQ interaccionan, el principal donador de hierro a NifQ es NifU. En A. vinelandii existen dos puntos de interés conocidos en la homeostasis de hierro desde el punto de vista de la fijación del nitrógeno : bacterioferritina A (BfrA), proteína citosólica de almacenaje de este metal, y NifU. Con el objetivo de encontrar nuevas proteínas involucrada en el tráfico de hierro se realizó un ensayo pull-down usando estas dos proteínas junto con un extracto de A. vinelandii DJ. De entre todos los interactores obtenidos, glutarredoxina D (GrxD) fue un candidato prometedor porque interaccionaba con ambas. Diferentes ensayos de copurificación confirmaron que GrxD solo interacciona con la ferritina cuando BfrA se encuentra cargada de hierro y GrxD no tiene su grupo sulfoférrico, indicando una posible transferencia de hierro con una dirección BfrA-GrxD. Por otro lado, la interacción NifU-GrxD ocurría de forma independiente al estado metálico de las proteínas, aunque era más fuerte cuando únicamente una de las proteínas implicadas estaba reconstituida con sus grupos sulfoférricos. Por último, mutantes en los genes grxD y bfrA fijan, de forma significativa, menos nitrógeno que la cepa silvestre. Todos estos datos sugieren que GrxD es requerida para la actividad nitrogenasa, teniendo una función en el metabolismo de hierro.