Traçage des protéines O-GlcNAcylées par la stratégie de suppression d'Ambre

La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle (MPT) régulée par deux enzymes antagonistes, l'OGT (O-GlcNAc transférase), qui transfère le résidu GlcNAc à partir de l'UDP-GlcNAc sur le groupe hydroxyle d'une sérine ou d'une thréonine des protéines cibles, et l'OGA (O-GlcNAcase) qui hydrolyse ce résidu. Cette MPT est étroitement liée à la voie de biosynthèse des hexosamines qui produit l'UDP-GlcNAc et fait intervenir différents nutriments tels que le glucose ou autres monosaccharides, les acides gras, l'UTP et l'ensemble des acides aminés, la glutamine en particulier. L'émergence de certaines pathologies, notamment le cancer, est associée à une O-GlcNAcylation aberrante. En ce sens, les travaux antérieurs de l'équipe ont indiqué une augmentation des niveaux d'expression de la β-caténine O-GlcNAcylée dans les cancers épithéliaux. Quatre sites de O-GlcNAcylation ont été identifiés au niveau de l'extrémité N-terminale de la β-caténine (S23/T40/T41/T112). La T41 revêt un intérêt particulier car elle influence la sensibilité au protéasome de la β-caténine selon qu'elle soit O-GlcNAcylée ou phosphorylée, les deux MPTs antagonistes jouant des fonctions opposées sur l'expression de la protéine. Cependant, il était difficile voire impossible de suivre spécifiquement cette protéine sous sa forme O-GlcNAcylée ou phosphorylée dans la même cellule. Pour pallier cette lacune, nous avons combiné la technologie d'expansion du code génétique avec la chimie click pour suivre la O-GlcNAcylation de la T41 en utilisant une S-GlcNAc, un analogue enzymatiquement stable de la O-GlcNAc. Une forme non modifiée en T41 ainsi qu'une forme phosphomimétique (T41E) de la β-caténine ont été générées. Nous avons synthétisé un ensemble de cassettes d'expression β-caténine-XFP (fusionnées ou non à un TAT-HA) et introduit le codon ambre TAG à la position T41 par mutagenèse dirigée du site pour produire la forme S-GlcNAcylée. Chaque forme (wt, T41S-GlcNAc et T41E) présentant une fluorescence spécifique a été produite chez E. coli, purifiée puis introduite en cellule humaine par transduction cellulaire ou par lipofection. Nos résultats indiquent que selon l'isoforme, les protéines n'occupent pas exactement le même espace dans la cellule, aucune superposition totale n'ayant été observée. La forme S-GlcNAcylée de la β-caténine en T41 semble plus stable dans le temps que la forme phosphomimétique, renforçant le rôle protecteur de la O-GlcNAcylation de la β-caténine vis-à-vis de la dégradation au contraire de sa phosphorylation.La technologie que nous avons développée doit permettre de fabriquer à façon des protéines modifiées par des groupements chimiques différents sur des sites bien précis, et d'en étudier l'impact sur le comportement de la protéine en réponse à divers stimuli.