Biogenèse des protéines à centre [Fe-S] et leur rôle dans la thiolation des ARNts

Les centres [Fe-S] sont des groupements prosthétiques essentiels et ubiquitaires, présents dans de nombreuses protéines impliquées dans multiples processus cellulaires. Le projet de thèse porte sur deux aspects de la biologie des protéines [Fe-S] en relation avec l'adaptation au stress : i) étude du maintien de l'homéostasie des protéines [Fe-S] en général et ii) étude de la biogenèse et du rôle de MnmA, une nouvelle protéine [Fe-S], sur la sulfuration des ARNts et son implication dans l'adaptation au stress. Les centres [Fe-S] sont construits et insérés au niveau des protéines lors d'un processus de maturation qui fait appel aux machineries Isc et Suf. En revanche, le processus par lequel les cellules gèrent les centres [Fe-S] endommagés en condition de stress n'est pas connu. Le projet de thèse consiste à s'interroger sur l'existence de voies de dégradation et de réparation des protéines [Fe-S] et, le cas échéant, étudier leur mode d'action. Nous avons alors créé une nouvelle base de données à partir d'analyses bio-informatiques répertoriant plus de 181 protéines [Fe-S] chez E. coli (Lénon et al., Metallomics, 2022). Parmi celles-ci, nous avons choisi un ensemble de 10 protéines, toutes différentes structurellement et fonctionnellement. Ces protéines ont été fusionnées en C-term à un SPA tag et exprimées dans une souche wt, un mutant iscUA (déficient dans la machinerie Isc) et un double mutant iscUA-sufABCDSE (souche déficiente dans les machineries Isc et Suf). Les conditions d'expression ont été mises au point pour permettre l'analyse i) du niveau d'expression des protéines [Fe-S], ii) de leur solubilité ainsi que iii) de leur dégradation in vivo au court du temps. 5 des protéines [Fe-S] se dégradent en condition d'aérobie. Cependant leur demi-vie est similaire sous la forme holo (wt) ou apo. Par ailleurs, les protéines [Fe-S] ont été soumises à différents stress in vivo (stress oxydant ou limitation en fer). Le niveau d'expression des 10 protéines reste identique quel que soit les conditions de stress appliquées. Ces résultats indiquent que les formes apo et holo possèdent des stabilités similaires indiquant qu'il n'y a probablement pas de système de recyclage/réparation ou d'élimination par protéolyse des protéines [Fe-S] apo. La deuxième partie de ma thèse porte sur la protéine MnmA. MnmA intervient dans une des modifications « universelles » des ARNs de transfert (ARNts) : la sulfuration de l'uridine 34 (s2U34). Deux voies de sulfuration s2U34 ont été décrites : l'une dépendante de protéines à centre [Fe-S] et l'autre indépendante de [Fe-S] de type MnmA. Cependant, nous avons découvert par analyses bio-informatique, génétique, spectroscopique et enzymatique que MnmA d'Escherichia coli possédait un centre [Fe-S] essentiel pour son activité catalytique. Cette découverte est en contradiction avec les précédentes informations publiées. Nous avons donc cherché à comprendre comment MnmA acquiert un centre [Fe-S] in vivo. Les organismes construisent et insèrent les centre [Fe-S] lors d'un processus de maturation contrôlé qui fait appel aux machineries Isc et Suf. Étonnamment, nous avons observé que MnmA conservait son activité de thiolation s2U34 dans une souche dépourvue de Isc et Suf, suggérant une nouvelle voie de maturation de MnmA non décrite jusqu'à présent. Nous avons également observé que le mutant mnmA est sensible au stress. Par conséquent, nous avons réalisé une analyse transcriptomique du mutant mnmA pour observer quels pourraient être les gènes du stress impactés par l'absence de mnmA. L'expression de 167 gènes a été modifiée dans le mutant mnmA. Curieusement, l'expression de la plupart des gènes correspondent à des gènes de biosynthèse de la cystéine, tous régulés par CysB un activateur transcriptionnel actif en conditions limitantes en soufre. Nos prochaines analyses porteront sur la compréhension du lien qu'il peut y avoir entre MnmA et le métabolisme du soufre.