Deciphering the mechanisms regulating the expression and secretion of the novel bacterial genotoxin EndA and its roles in Shigella flexneri virulence

Décrypter les mécanismes régulant l'expression et la sécrétion de la nouvelle génotoxine bactérienne EndA et son rôle dans la virulence de Shigella flexneri Les génotoxines bactériennes sont définies comme des toxines dont la cible moléculaire directe est l'ADN eucaryote. Bien que les effets génotoxiques des infections bactériennes aient été documentés, un nombre très limité de génotoxines bactériennes a été clairement identifié. L'entéropathogène Shigella flexneri induit un stress génotoxique dans les cellules épithéliales. En utilisant une approche biochimique combinant chromatographie et spectrométrie de masse, le laboratoire a identifié l'endonuclease EndA, dont le gène est codé par le chromosome bactérien, comme la principale cause de stress génotoxique lors d'une infection à Shigella. Dans ce contexte, nous avons d'abord étudié les mécanismes régulant l'expression et la sécrétion de cette génotoxine. En condition d'anaérobie, nous montrons que FNR (Fumarate and Nitrate reductase Regulatory), un régulateur transcriptionnel sensible à l'oxygène de E. Coli nécessaire pour le passage du métabolisme aérobie au métabolisme anaérobie, est un régulateur positif de l'expression de EndA. Dans des conditions aérobies, nous montrons que l'expression de EndA est biphasique, prédominante lors de la croissance exponentielle et sous la dépendance de la pyruvate déshydrogénase (PDH), un complexe enzymatique métabolique impliqué dans la conversion du pyruvate en acétyl-CoA et NADH. De plus, nous montrons que la toxine est co-exprimée avec la sous unité E1 du complexe PDH dans chaque étape de la croissance bactérienne. De façon intéressante, nous montrons que EndA et le composant pyruvate déshydrogénase E1 forment un complexe moléculaire, ce qui suggère la possibilité que la PDH puisse être une protéine à multiples fonctions de type « moonlighting », agissant à la fois comme une enzyme métabolique et un chaperon moléculaire stabilisant l'expression de la protéine EndA. Afin d'identifier des partenaires moléculaires impliqués dans la sécrétion de EndA, nous avons réalisé une analyse en protéomique de l'interactome EndA. Les composants du système de sécrétion de type III et les protéines de la membrane externe ont été identifiés comme des interactants potentiels de EndA. Nous démontrons que le signal peptidique N-terminal de la toxine est nécessaire pour son transport du cytoplasme au périplasme, ce qui rend EndA principalement localisée dans le périplasme de la bactérie, favorisant ainsi sa libération par la production de vésicules de membrane externe (OMV). Enfin, nous avons étudié l'implication de EndA dans la virulence de Shigella flexneri. Dans les lignées de cellules entérocytaires infectées, nous montrons que EndA restreint le nombre de bactéries intra-cellulaires, limitant ainsi la mort de sa niche épithéliale. De plus, dans un modèle cobaye d'entérite aiguë dans le côlon, nous montrons que EndA induit des dommages à l'ADN dans les cellules épithéliales de l'hôte et de manière inattendue dans les polynucléaires neutrophiles (PMNs). De manière cohérente, nous montrons in vitro que EndA déclenche un stress génotoxique dans la lignée cellulaire HL60 de type neutrophile et dans les PMNs humains. De plus, EndA limite la formation de pièges extracellulaires des neutrophiles (NET) in vitro, suggérant que l'activité DNase de la toxine pourrait constituer une stratégie bactérienne d'échappement à la destruction par les PMNs. En conclusion, nos travaux caractérisent un nouveau membre de la famille des génotoxines bactériennes, et révèle les fonctions potentielles de cette famille d'effecteurs bactériens dans l'adaptation bactérienne à la niche de l'hôte et l'immunité infectieuse.