Functional investigation of Shigella flexneri vacuolar rupture through in situ ultrastructural analysis

Étude fonctionnelle de la rupture vacuolaire de Shigella flexneri par analyse ultrastructurale in situ Les agents pathogènes intracellulaires s'établissent dans des endroits spécifiques à l'intérieur des cellules cibles, appelés niches intracellulaires. Après leur entrée dans la cellule hôte, la première niche de tous les pathogènes bactériens est un compartiment membranaire, connu sous le nom de vacuole contenant des bactéries (VCB). Certains agents pathogènes ont la capacité de s'échapper de cette niche vacuolaire pour se multiplier dans le cytosol de la cellule hôte. Cette transition d'une niche à l'autre joue un rôle essentiel dans la progression des infections. L'une de ces bactéries est Shigella flexneri, agent responsable de la dysenterie bacillaire (shigellose) chez l'homme. L'invasion des cellules eucaryotes par Shigella repose l'action système de sécrétion de type III (SST3), une seringue moléculaire appelée « l'aiguille du SST3 ». Ce système injecte plus de 20 effecteurs bactériens dans les cellules hôtes, lesquels agissent en synergie pour remodeler les voies critiques de la cellule hôte, favorisant ainsi les étapes successives de l'invasion et de la formation de niches intracellulaires. La caractéristique de la formation de niches intracellulaires par Shigella est son évasion efficace dans le cytosol de la cellule hôte où elle se développe et se propage de cellule en cellule. Des travaux antérieurs ont montré que la rupture de la VCB de Shigella implique des événements séquentiels, commençant par un endommagement initial de la VCB suivi de la séparation complète des membranes brisées de la VCB de la bactérie. La dissociation de la membrane a été étudié de façon assez détaillée, mais la manière dont les dommages initiaux de la membrane de la VCB se produisent est restée insaisissable. Le rôle direct du SST3 dans le contexte de la rupture de la vacuole de Shigella et de la formation subséquente d'une niche cytosolique doit être caractérisé avec précision. Pour comprendre comment le SST3 est impliqué dans les premières étapes des dommages causés à la VCB, nous avons développé un pipeline de microscopie en corrélative cryo-CLEM (Correlative Light Electron Microscopy), combinant la cryo-microscopie électronique à transmission et l'imagerie par cryo-fluorescence. Cela a permis d'obtenir des informations fonctionnelles à l'échelle cellulaire et des données ultrastructurales dans des conditions proches de l'état natif. J'ai appliqué ce pipeline cryo-CLEM in situ pour imager pour la première fois les premières étapes successives de l'invasion des cellules épithéliales par Shigella à haute résolution. Au cours de ces événements, nous avons résolu le SST3 de Shigella et sa distribution à la surface de la bactérie, sa morphologie et ses dimensions au cours de l'infection. En appliquant le pipeline à différents moments de l'infection, j'ai été en mesure d'imager les stades de rupture vacuolaire avant et au début de l'infection, ce qui a permis d'identifier la rupture locale de la membrane de la VCB. De plus, j'ai analysé la morphologie de la membrane de la VCB à proximité du SST3 afin de corréler la présence du SST3 et les dommages membranaires. Enfin, en utilisant une approche de biologie synthétique avec des E. coli exprimant un SST3 réduit de Shigella, j'ai pu identifier les facteurs bactériens minimaux nécessaires pour endommager la VCB. Dans l'ensemble, j'ai pu récapituler les étapes de la rupture de la VCB de Shigella au niveau ultrastructural, offrant ainsi une nouvelle perspective sur les processus menant à la rupture vacuolaire. Ce travail décrit, au niveau des complexes moléculaires, la pertinence des premières étapes de la rupture vacuolaire dans la formation de la niche intracellulaire d'un pathogène cytosolique.