Mise en évidence d’une interaction entre la protéine 53BP1 et les fragments d’Okazaki

Le maintien de l’intégrité du génome est un processus crucial à la vie cellulaire. Ce n’est que récemment que les protéines de liaison à l’ARN (« RNA-binding protein » ou RBP) ont été montré être impliquées dans ce processus. En présence d’ADN endommagé, les RBP régulent l’expression des gènes de réponse aux dommages de l’ADN et contrôlent le destin cellulaire. Elles jouent également un rôle plus direct dans la prévention et la réparation des dommages de l’ADN. De plus, des ARN sont présents aux sites de dommages de l’ADN et participent au maintien de l’intégrité du génome. Ainsi, le laboratoire recherche des acteurs protéiques capables de lier directement l’ARN au sein des protéines médiatrices de la réponse aux dommages de l’ADN. Un des candidats est la protéine 53BP1 (p53 binding protein 1) qui contient un domaine de liaison à l’ARN nommé domaine GAR (« Glycine-Arginine Rich »). 53BP1 est un acteur central de la signalisation des cassures double-brin de l’ADN et de la régulation de leur réparation par le processus de jonction d’extrémités non homologues pendant la phase G1 du cycle cellulaire. Le recrutement de 53BP1 aux sites de dommages de l'ADN dépend à la fois d'interactions directes entre 53BP1 et des marques d’histones, mais aussi d’une composante ARN.L’objectif était d’étudier l’interaction entre 53BP1 et l’ARN.Grâce aux méthodes de CLIP (« CrossLinking and ImmunoPrecipitation ») et de 2C (« Complex Capture »), nous avons montré que 53BP1 possède une activité de liaison directe à l'ARN, via son domaine GAR. Nous avons identifié l’acide nucléique interagissant avec 53BP1 comme étant une chimère ARN-ADN constituée d’une partie d’environ 10 ribonucléotides, suivie d’environ 100 désoxyribonucléotides. Ce type de molécule est très similaire à celle des fragments d’Okazaki qui sont impliqués dans l’initiation de la synthèse du brin retardé de la fourche de réplication. Par la méthode de SIRF (« In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks »), nous avons montré que 53BP1 est présent au niveau de l’ADN naissant, dans un contexte de réplication normal. De plus, la déplétion de la sous-unité catalytique de la primase (PRIM1) qui synthétise l’amorce ARN des fragments d’Okazaki, conduit à la diminution de la présence de 53BP1 à proximité d’ADN naissant. La déplétion de PRIM1 affecte également l’interaction de 53BP1 avec la chimère ARN-ADN in vivo. Ces résultats indiquent que 53BP1 est présent à la fourche de réplication via une interaction directe avec les fragments d’Okazaki. Enfin, sous stress réplicatif induit par l’hydroxyurée, la présence de 53BP1 au niveau de l’ADN naissant est fortement augmentée, indiquant que 53BP1 s’accumule aux fourches de réplication bloquées. L'ensemble de ces résultats montre que 53BP1 est une protéine de liaison aux ARN qui interagit directement avec les fragments d’Okazaki.