Study of the splicing factor CWC27 and its link to genetic diseases and EJC assembly

Étude du facteur d'épissage CWC27 et de son lien avec les maladies génétiques et l'assemblage de l'EJC Chez les métazoaires, la majorité des gènes codant des protéines contiennent des introns qui sont excisés par la machinerie d’épissage ou « spliceosome » pendant leur transcription. En plus d’enlever les introns, l'étape d'épissage habille les ARNm naissants avec des protéines de liaison à l'ARN (RBPs) qui modulent les étapes suivantes du cycle de vie des ARNm. Le complexe EJC (Exon Junction Complex) déposé par le spliceosome sur les ARNm est un composant majeur de l’ensemble des protéines couvrant les ARNm (particules mRNP). L'EJC est structurellement organisé autour de l'ARN hélicase eIF4A3 qui sert de plate-forme de liaison pour de multiples facteurs annexes. EIF4A3 est spécifiquement recrutée par la machinerie d’épissage par le facteur d’épissage CWC22 avant l'excision des introns. L’EJC joue un rôle central dans le devenir des ARNm en contribuant à la régulation de l’épissage alternatif ainsi que de la localization, la traduction et la dégradation des ARNm. De multiples interrogations subsistent quant au mécanisme par lequel les EJCs sont assemblés par le spliceosome ainsi que le lien existant entre l'expression altérée de protéines de l’EJC et des défauts de développement ou des pathologies humaines. L’objectif de mon doctorat est de caractériser le facteur d'épissage CWC27 dont la fonction précise est inconnue. La première partie de mon travail de recherche consiste en la caractérisation de mutations pathogènes identifiées dans le gène humain CWC27 en collaboration avec des généticiens humains. Cette étude a révélé que des mutations tronquantes de CWC27 sont associées à un phénotype de Rétinite pigmentaire (RP) avec parfois des défauts de développement. J'ai notamment montré que la mutation homozygote c.599+1G>A de CWC27 conduit à l'expression de deux nouveaux transcrits alternatifs contenant un codon de terminaison précoce (PTC). Dans un deuxième temps, j’ai caractérisé biochimiquement et fonctionnellement la protéine CWC27. Afin de purifier efficacement CWC27, j’ai fusionné la protéine endogène avec une étiquette d'affinité FLAG introduite dans le génome des cellules HeLa par la méthode CRISPR-Cas9. La précipitation de FLAG-CWC27 couplée à la spectrométrie de masse quantitative a identifié CWC22 et eIF4A3 comme des partenaires majeurs de CWC27. En exprimant des versions sauvages ou tronquées de CWC22 et CWC27, nous montrons que le domaine C-terminal de CWC27 est médiateur de l'interaction avec CWC22 et eIF4A3. Les mutations correspondant à celles observées chez les patients entraînent la perte des interactions avec CWC22 et eIF4A3. Puis, en utilisant des protéines recombinantes, nous avons reconstitué in vitro le complexe trimérique CWC27/CWC22/eIF4A3 et montré que CWC27 stabilise la liaison de eIF4A3 à CWC22. En collaboration avec des biologistes structuraux, nous avons résolu la structure 3D du complexe CWC27/CWC22/eIF4A3. Cette structure éclaire les premiers contacts de eIF4A3 avec les facteurs d’épissage. Puis, nous avons étudié par RNA-seq, l'impact de la perte de CWC27 sur le transcriptome de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines immortalisées. Un ARN interférent anti-CWC27 entraîne d'importants changements dans l'expression des gènes, y compris des défauts d'épissage, et beaucoup sont communs aux à ceux dus à la perte de CWC22. De nombreux gènes codant pour des facteurs impliqués dans l'inflammation sont fortement affectés par la perte de CWC27 ou CWC22, ce qui pourrait rendre compte du phénotype Rétinite pigmentaire. Nos résultats révèlent que CWC27 est impliquée dans les premières étapes de l'assemblage de l'EJC. Ils établissent un lien inattendu entre des mutations des facteurs d'épissage centraux et l'activation de l'inflammation dans l'épithélium rétinien. Cette étude ouvre la voie à la compréhension des causes moléculaires de la dégénérescence rétinienne associée aux spliceosomopathies humaines.