3D Analyse offenbart fortschreitende Zerstörung von alpha-Aktin positiven Strukturen in entsprechend fortschreitenden Graden des follikulären Lymphoms

Das follikuläre Lymphom (FL) stellt eine indolente, maligne Neoplasie des Lymphsystems dar und repräsentiert den häufigsten Subtyp des Non-Hodgkin Lymphoms. Es handelt sich um einen keimzentrumslokalisierten Tumor, der nicht nur mit einer neoplastischen Transformation von B-Zellen assoziiert ist, sondern auch mit Veränderungen der Mikroumgebung einhergeht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Tumorgenese auf die morphologische Integrität der keimzentrumsbegrenzenden Strukturen, insbesondere der Wälle und Löcher im Kontext des FL, zu evaluieren. Da diese Strukturen maßgeblich durch das fibroretikuläre Netzwerk (FRC-Netzwerk) gebildet werden, wurde dessen Rolle im Kontext der Tumorprogression detailliert untersucht. Das FRC-Netzwerk an der Grenze der B- und T-Zell-Zonen spielt eine zentrale Rolle bei der Etablierung einer Immunantwort, indem es zur funktionellen Kompartimentalisierung des Lymphknotens beiträgt und somit regulatorisch immunologische Prozesse maßgeblich beeinflusst. Das retikuläre Netzwerk weist unterschiedliche morphologische Ausprägungen auf. Es bildet unter anderem wandartige Strukturen bzw. Wälle aus, die sukzessive von perforierenden Löchern durchsetzt sind. Wie sich diese Wälle und Löcher im Rahmen der Tumorgenese des FL morphologisch veränderten, war der Fokus dieser Arbeit. Während die Untersuchung von zweidimensionalen histologischen Schnitten weiterhin die Goldstandardmethode zur Untersuchung von FL darstellt, kann eine dreidimensionale Analyse der Zellmorphologie, räumlichen Beziehungen und Netzwerkkonnektivität des retikulären Netzwerks zusätzliche Erkenntnisse über die Tumorgenese des FL liefern. Zur dreidimensionalen Visualisierung wurde konfokale Lasermikroskopie bei dieser Arbeit eingesetzt. Für die Bildverarbeitung wurde die Software Imaris Advanced Tracking 9.6.0 von Bitplane AG (Badenerstraße 682, CH-8048 Zürich) verwendet. Die Gewebeproben wurden vom ehemaligen Konsultationszentrum für Lymphknoten und Lymphom Pathologien der Goethe-Universität in Frankfurt am Main bereitgestellt. Zur Visualisierung des FRC-Netzwerks erfolgte eine immunhistochemische Färbung der Proben mit alpha-smooth muscle actin. Im Rahmen der Analyse wurden insgesamt 40 Bilddatensätze unter Verwendung der Software Imaris evaluiert und hinsichtlich Lochgrößen und Länge der Wälle detailliert analysiert. Berechnungen und statistische Analysen wurden mithilfe von Python 3.7 durchgeführt. Zur Auswertung der Ergebnisse wurde der Kruskal-Wallis-Test, der Dunn-Test sowie der Pearson-Korrelationskoeffizient verwendet. Insgesamt wurden 397 Löcher innerhalb der keimzentrumsbegrenzenden Wälle vermessen. Untersucht wurden ausschließlich Löcher innerhalb der Wälle, die vollständig umschlossen und nicht aufgerissen waren. Die Größe der Löcher zeigte eine Zunahme von Grad 1-3a (Pearson-Korrelationskoeffizient +0.44). Der Unterschied der Lochgröße war statistisch signifikant zwischen Grad 1 und 3a/3b sowie zwischen 2 und Grad 3a/3b (Dunn-Test). Eine Zunahme der Größe konnte festgestellt werden. Die Löcher zeigten in Proben des Grads 1 und 2 eine kleinere, runde oder elliptische Morphologie, während sie in Grad 3a und 3b eher eine längliche oder palisadenartige Form annehmen oder gänzlich aufgerissen waren. Untersucht wurden ebenfalls die Längen der keimzentrumsbegrenzenden Wälle. Als Wall wurde eine glatte, morphologisch klar abgegrenzte Struktur innerhalb des FRC-Netzwerks verstanden, die sich kontinuierlich entlang der Z-Achse des analysierten Bildvolumens erstreckte. Es bestand eine positive Korrelation zwischen der Länge der 181 analysierten Wall-Strukturen und dem Grad des Lymphoms (Pearson Korrelationskoeffizient 0.5). Der Unterschied in der Walllänge zwischen den Graden war statistisch signifikant, mit Ausnahme des Vergleichs zwischen Grad 1 und Grad 2. Es zeigte sich eine Abnahme der Wall-Längen. Es wurde eine ungleichmäßige Verteilung der Wälle in Bezug auf ihre Lokalisation im Keimzentrum beobachtet. Ein Pol des Keimzentrums wies eine erhöhte Durchlässigkeit auf und zeigte eine stärkere Auflösung als der gegenüberliegende Pol. Diese Polarisierung der Zerstörung nahm mit zunehmenden Graden ab, während sich der strukturelle Zerfall auf den gesamten Umfang der keimzentrumsbegrenzenden Wälle ausbreitete. Mittels der 3D-Analyse zeigte diese Studie erstmals, dass sich die keimzentrumsbegrenzenden Strukturen in Lymphknoten im Grad 1 bis 3b des FL mit fortschreitenden Graden zunehmend auflösen. In dieser Arbeit konnte erstmalig herausgearbeitet werden, dass Unterschiede zwischen niedrigen und hohen Graden festzustellen sind, da höhere Grade von einer umfassenderen Netzwerkzerstörung gekennzeichnet sind. Dieser strukturelle Abbau kann die Permeabilität dieser Barrieren für neoplastische Zellen erhöhen. In FL Grad 1 und 2 sind neoplastische B-Zellen vor allem im Keimzentrum zu finden, während in FL Grad 3a und 3b diese Zellen den gesamten Lymphknoten infiltrieren. Diese Wallstrukturen sind als keimzentrumsbegrenzende Strukturen und als mechanische Barrieren, die die Zellmigration begrenzen und regulieren, beschrieben. Wenn die keimzentrumsbegrenzenden Wälle aufgelöst würden, könnte dies zu einem Verlust der Regulation der Zellmigration führen. Auch könnte der Abbau der mechanischen Barriere zu einem Verlust des Chemokingradienten führen und so erheblichen Einfluss auf die immunologische Funktionalität des Lymphknotens haben. Als Folge kann es zu einer Dekompartimentalisierung führen, wodurch essenzielle Immunfunktionen nicht mehr aufrechterhalten werden können. Die Remodellierung des retikulären Netzwerks und der Verlust der keimzentrumsbegrenzenden Eigenschaften kann somit zu einer Ausbreitung des Tumors und zu Verlust immunologischer Kompetenz führen. Eine Veränderung der Makrophagenaktivität, die eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des Wirtsgewebes und Immunabwehr spielt, könnte zu dieser Zerstörung der FRC-Netzwerke führen. So ist ein Zusammenhang von einer hohen Dichte von Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) mit einem schlechteren Verlauf bei Patienten mit soliden Tumoren beschrieben worden. Zusammenfassend untersuchte diese Arbeit somit erstmalig mithilfe von 3D-Techniken den zunehmenden Zerfall bei zunehmender Malignität in Grad 1-2 des FL bis zu einem vollständigen Zerfall der keimzentrumsbegrenzenden Wälle des FRC-Netzwerks in fortgeschrittenen Graden. Untersucht wurden dysplastische Lymphknoten menschlichen Ursprungs bei denen die Unterschiede des Verfalls der alpha-Aktin positiven FRC-Netzwerkstrukturen im FL hinsichtlich verschieden fortgeschrittener Tumorstadien betrachtet wurden.