Charakterisierung und funktionelle Analyse von humanen Kolonkarzinomzelllinien mit stabilem genetischem Knockdown von TRIM25

Die E3-Ubiquitinligase TRIM25 ist in verschiedenen humanen Tumoren verstärkt exprimiert, was häufig mit einer schlechten Prognose der betroffenen Patienten sowie dem Auftreten von Therapieresistenzen korreliert. Unsere Arbeitsgruppe konnte TRIM25 zuvor als Caspase-2 und -7 mRNA-bindendes Protein und negativen Regulator beider Caspasen in humanen Kolonkarzinomzellen identifizieren. Ein transienter TRIM25 Knockdown führt in Abhängigkeit der erhöhten Expression der jeweiligen Caspasen zur Sensitivierung der Kolonkarzinomzellen gegenüber Chemotherapeutika-induzierter Apoptose. Ein Ziel dieser Arbeit war, die Übertragbarkeit dieser Erkenntnisse auf einen loss-of-function-Ansatz mit stabilen TRIM25 Knockdown Zellen zu überprüfen. Die stabilen Knockdown Zellen sollten der späteren Etablierung eines Xenograftmodells dienen. Da zahlreiche TRIM Proteine bekannterweise eine vielseitige Rolle bei der Regulation sowohl onkogener als auch tumorsuppressiver Prozesse einnehmen, wurde als weitere maßgebliche Fragestellung dieser Arbeit der Einfluss von TRIM25 auf wichtige tumorigene Eigenschaften wie Proliferation, Migration, Zellzyklus und Inflammation untersucht. TRIM25-abhängige Effekte auf das Migrationsver halten von RKO-Zellen wurden im in vitro-Wundheilungsassay mit stabilen TRIM25 Knock down Zellen analysiert. Aufgrund hoher interexperimenteller Unterschiede im Migrations verhalten derselben Zellklone konnte hinsichtlich einer TRIM25-abhängigen Regulation der Migration jedoch keine eindeutige Aussage getroffen werden. Dagegen belegten die gezeigten Proliferationsassays eine signifikant vermehrte Proliferation von RKO-Zellen nach stabilem TRIM25 Knockdown. Dies legt eine tumorsuppressive Rolle von TRIM25 nahe. Durch flusszytometrische Analysen stabiler TRIM25 Knockdown und Kontrollzellen zeigten hinge gen keinen konsistenten Einfluss von TRIM25 auf den Zellzyklus von RKO-Zellen. Eine Sensitivierung von Kolonkarzinomzellen gegenüber Chemotherapeutika-induzierter Apoptose konnte auch in stabilen TRIM25 Knockdown Zellen nachgewiesen werden, während die für transiente Ansätze bekannte, TRIM25 Knockdown-abhängige Hochregulation von Caspase 2 und -7 dagegen deutlich geringer ausgeprägt war. Dies lässt vermuten, dass die Tumorzellen einer Hochregulation Zelltod-induzierender Proteine bei einem konstitutiven TRIM25Knockdown gegenregulieren. Aufgrund der aber nach wie vor nachweisbaren Sensitivierung der TRIM25 Knockdown Zellen gegenüber Apoptose, können zusätzliche, bisher noch nicht bekannte Mechanismen postuliert werden, welche zur Sensitivierung dieser Zellen gegenüber Apoptose beitragen. Die daraus abgeleitete, TRIM25-abhängige Apoptosehemmung spricht für einen „Überlebensmechanismus“, welcher maßgeblich zur Chemotherapieresis tenz von Kolonkarzinomzellen beitragen kann. Hinsichtlich eines Einflusses von TRIM25 auf entzündliche Prozesse wurden RKO-Zellen mit klassischen Aktivatoren des NLRP3-Inflammasoms stimuliert und ausgewählte Marker mittels Western Blot-Analysen nachgewiesen. TRIM25 Knockdown-abhängig war eine verminderte Spaltung der Apoptosemarker Caspase-3, -7 und PARP-1 nachweisbar. Caspase-7 und PARP-1 spielen bekanntermaßen auch im Rahmen Inflammasom-induzierter Signalprozesse eine wichtige Rolle, während die Spaltung von Caspase-3 durch das NLRP3-Inflammasom induziert werden kann und v.a. für apoptotische oder pyroptotische Prozesse verantwortlich gemacht wird. Daher kann postuliert werden, dass der stabile TRIM25 Knockdown zur Hemmung von Inflammasom-induzierten Signalprozessen führt und darüber Kolonkarzinomzellen vor Apoptose/Pyroptose geschützt werden. Umgekehrt deutet dies auf eine Aktivierung von Inflammasom-vermittelten Signalprozessen durch TRIM25 hin. Aufgrund der hohen Inzidenz und Mortalität, der schlechten Prognose und der Entwicklung von Therapieresistenzen besteht ein dringender Bedarf in der Entwicklung neuer, verbesserter Therapien des kolorektalen Karzinoms sowie der Resensibilisierung der Krebszellen gegenüber gängigen, bereits bestehenden Therapieoptionen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein onkogener Einfluss von TRIM25 auf Kolonkarzinomzellen durch Hemmung Chemotherapeutika-induzierter Apoptose nachgewiesen werden, während eine mögliche tumorigene Rolle von TRIM25 durch zusätzliche Aktivierung Inflammasom-induzierter Signalprozesse weiterer Untersuchungen bedarf. Zusammenfassend kann TRIM25 als vielversprechender therapeutischer Angriffspunkt für die Entwicklung von sowohl neuen antientzündlichen als auch tumorsuppressiven Therapien betrachtet werden.