Liquid-liquid phase separation of RNA/peptide biomolecular condensates under passive and active conditions

Séparation de phase liquide-liquide des condensats biomoléculaires ARN/peptide en conditions passives et actives Les condensats biomoléculaires sont des organites sans membranes formés par séparation de phase liquide-liquide des protéines et des acides nucléiques. Ils jouent un rôle clé dans l'organisation des réactions biochimiques cellulaires, et leur assemblage ou désassemblage est souvent régulé par des activités enzymatiques comme la phosphorylation ou la déphosphorylation. Bien que la séparation de phase ait été largement étudiée, le rôle précis de l'activité enzymatique dans la dynamique et la structure interne des condensats reste mal élucidé, notamment en raison des difficultés à explorer les échelles de temps et de longueur pertinentes. Cette thèse présente un état de l'art sur les condensats biomoléculaires et les principes fondamentaux des techniques de diffusion aux petits angles, utilisées pour étudier leur structure et leur dynamique à différentes échelles. Nous avons étudié des condensats formés par un peptide phosphorylable riche en arginine (RRASLRRASL) et de l'ARN poly(uridylique) (polyU) comme système modèle simple. Toutes les expériences ont été réalisées à 37 °C pour maintenir des conditions physiologiques. Grâce à la diffusion des rayons X aux ultra-petits angles résolue en temps (TR-USAXS), à la diffusion des neutrons aux petits angles (SANS), à la microscopie confocale, à la spectrophotométrie et à des simulations de dynamique moléculaire à gros grains, nous avons suivi les mécanismes d'assemblage et de désassemblage des condensats sur des échelles de temps allant de la milliseconde à la minute et de longueur du nanomètre au micromètre. En conditions passives, où les condensats se forment spontanément par interactions électrostatiques entre le peptide et l'ARN, nous avons établi le diagramme de phase et les concentrations critiques régissant la séparation de phase. Les mesures d'absorbance et l'imagerie confocale ont révélé des gouttelettes sphériques micrométriques atteignant un état stable en quelques minutes. Les expériences TR-USAXS sur source synchrotron montrent que le rayon moyen des condensats augmente avec le temps suivant une loi d'échelle t^{1/3}, cohérente avec une croissance dominée par la coalescence ou le mûrissement d'Ostwald, tandis que la densité numérique décroît comme t^{-1}. Les simulations de dynamique moléculaire à gros grains indiquent que les chaînes d'ARN décorées de peptides s'assemblent rapidement après le mélange, formant les sous-unités de croissance des condensats.En conditions actives, la formation est initiée par la déphosphorylation enzymatique du peptide initialement phosphorylé par la Lambda Protéine Phosphatase (LPP). La spectrophotométrie et les mesures TR-USAXS ont révélé une formation retardée et un mécanisme de croissance en deux étapes : apparition d'agrégats fractals peu denses, suivie de leur coalescence en gouttelettes sphériques plus compactes. La récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) a montré une diffusivité plus élevée des peptides à l'intérieur des condensats formés activement, en accord avec leur structure locale moins dense. La protéine kinase A (PKA) a été utilisée pour étudier le désassemblage enzymatique de condensats préformés. La phosphorylation des résidus sérine par PKA neutralise la charge positive du peptide, affaiblissant son attraction électrostatique avec l'ARN et entraînant la dissociation progressive des condensats, comme révélé par les mesures TR-USAXS et les simulations numériques. Dans l'ensemble, mes travaux de thèse combinent des techniques avancées de diffusion, la microscopie confocale en temps réel et des simulations moléculaires pour élucider les principes fondamentaux de la formation des condensats et démontrer comment les activités enzymatiques régulent leur assemblage, leur croissance et leur désassemblage. Ce travail offre une vision intégrée de la manière dont les processus biochimiques gouvernent la structure et la dynamique des organites dépourvus de membrane dans les cellules vivantes.