Extended-source wavefront sensing for two-photon microscopy and in-depth neuroimaging

Optique adaptative en source étendue pour la microscopie de fluorescence à deux photons et la neuroimagerie La microscopie optique s'est imposée comme un outil majeur en neurosciences, car elle permet de réaliser des images structurelles et des enregistrements de l'activité fonctionnelle dans de grands volumes de tissus avec une résolution subcellulaire. De plus, la microscopie non linéaire permet d'étudier l'activité neuronale dans le cerveau de petits mammifères mais reste limitée en profondeur : la diffusion et les aberrations optiques, dues à l'inhomogénéité de l'indice de réfraction, limitent la résolution et font chuter l'intensité du signal. En effet, les aberrations rencontrées sur le trajet d'excitation affectent significativement la qualité de l'imagerie lorsque la profondeur augmente. Pour surmonter ces problèmes, des stratégies d'optique adaptative (OA) ont été mises en œuvre pour améliorer la qualité d'imagerie du microscope même à des profondeurs importantes, permettant par exemple l'imagerie fonctionnelle à haute résolution avec un microscope à deux photons dans les couches corticales infragranulaires de la souris. Alors qu'une première stratégie d’OA, largement mise en œuvre en microscopie non linéaire, repose sur une configuration sans capteur, et donc sur un processus itératif chronophage, une deuxième approche, basée sur la mesure directe du front d'onde à l'aide d'analyseur de front d'onde de type Shack-Hartmann, et utilisant la mesure de centroïdes, a prouvé son efficacité in vivo. Cependant, cette méthode échoue à grandes profondeurs dans les tissus en raison de la forte diffusion de la fluorescence utilisée pour la mesure du front d'onde. Une méthode de mesure directe du front d'onde plus résistante à la diffusion du signal émis permettrait donc d'améliorer l'utilisation de l'OA en microscopie optique pour l’imagerie d’échantillons biologiques épais. Cette thèse propose une méthode alternative de mesure directe du front d'onde qui tire parti des méthodes de marquage existantes des échantillons biologiques et qui repose sur l'intercorrélation des images d'une source étendue, obtenues à travers un réseau de microlentilles. Cet analyseur de front d’onde de Shack-Hartmann en source étendue (ESSH), précédemment couplé à la microscopie à feuille de lumière pour la neuroimagerie chez la drosophile adulte, est ici confronté à des régimes plus diffusifs. Nous montrons que cette méthode permet des mesures quantitatives d'aberrations à travers des tranches de cerveau fixées hautement diffusantes, à des profondeurs atteignant jusqu'à quatre fois la longueur de diffusion du tissu et montrons qu'elle est plus résistante à la diffusion que l'approche actuelle basée sur la mesure de centroïdes. Nous présentons ensuite sa mise en œuvre sur un microscope à deux photons dans une configuration en boucle fermée pour la neuroimagerie en profondeur chez la souris et nous comparons ses performances dans des milieux diffusants à l'approche descannée en centroïde. Enfin, nous présentons des résultats d'imagerie en profondeur dans des tranches de cerveaux de souris fixées.