Studies of low-density lipoproteins by cryo-electron microscopy and neutron scattering

L'étude de la lipoprotéine à basse densité par microscopie électronique et diffusion neutronique Les lipoprotéines à basse densité (LDL) jouent un rôle crucial dans le métabolisme du cholestérol. Responsables de son transport du foie vers les organes, leur accumulation dans les artères est à l’origine de maladies cardiovasculaires, telles que l’athérosclérose. Constituées d’un cœur composé de cholestérol, dans sa forme libre ou estérifié, ainsi que de triglycérides, les LDL sont entourées d’une membrane de phospholipides, ainsi que d’une protéine immense : l’apolipoprotéine B-100 (apo B-100). Sur la LDL, la protéine contient des parties exposées en surface, et d’autres partiellement incorporées dans la membrane. Apo B-100 est impliquée dans de nombreuses fonctionnalités de la LDL, comme la réception des LDL par les organes, ou la conversion des VLDL (lipoprotéines à très basse densité) en LDL.Dans ce contexte, ce travail de thèse s’est concentré sur plusieurs questions fondamentales, qui sont encore peu étudiées : Quelle est la structure d’une LDL et où se trouve la protéine apo B-100 ? Quelle est la dynamique moléculaire d’apo B-100 ?Dans un premier volet, la dynamique d’apo B-100 a été étudiée par diffusion incohérente élastique et quasi-élastique de neutrons (EINS, QENS), des techniques qui permettent d’accéder à des échelles de temps de la picoseconde à la nanoseconde. De par la nature de apo B-100, et des conséquences de son extraction, les mesures ont donné lieu à de nouvelles problématiques. En effet, l’échantillon final inclut à la fois apo B-100, mais aussi le détergent utilisé pour sa solubilisation ; Nonidet P-40 (NP40). Hors, les mesures de diffusion incohérente intègrent toutes les contributions des atomes d’hydrogène, à la fois la protéine ou le détergent. Pour séparer les contributions, et apporter une solution à un problème qui ne se rencontre pas seulement dans le cas d’apo B-100, mais plus généralement avec les protéines membranaires, nous avons construit un nouveau modèle pour analyser les données QENS. Nous avons ainsi mis en évidence l’accélération de la dynamique interne de NP40 en présence de apo B-100, par comparaison aux mesures sur NP40 pur. En outre, nous avons pu quantifier la dynamique moléculaire d’apo B-100. Avec cette méthodologie, nous espérons ouvrir la voie à plus d’études dynamiques en diffusion de neutrons sur des systèmes comme les protéines membranaires, où la présence de détergent doit être prise en compte.En parallèle des travaux sur la dynamique, nous avons exploré la structure des LDL entières par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), avec ces objectifs en tête : améliorer la qualité des cartes 3D de LDL au vu des récentes évolutions techniques, et localiser la protéine apo B-100 à la surface de la LDL. En cryo-EM, les images des LDL servent de base pour reconstruire une carte 3D. Comme les orientations des LDL ne sont pas connues a priori, la reconstruction 3D s’appuie sur différents logiciels de reconstruction, tels que RELION et cryoSPARC. Leur application a d’abord permis de quantifier plus précisément les couches de cholestérol estérifié observées dans le cœur des LDL à basse température, et nous proposons un modèle révisé de bicouches. Concernant la localisation de apo B-100, notre carte soutient le modèle actuel dans lequel apo B-100 « ceinture » la LDL. Néanmoins, elle n’a pas permis d’obtenir des détails sur la protéine, comme des hélices alpha ou feuillets bêta, ce qui indique que apo B-100 serait extrêmement flexible sur la LDL, une propriété qui n’était pas un consensus dans la communauté des LDL jusqu’ici. La présence de lipides, couplée à une importante flexibilité de apo B-100, font de la reconstruction à haute résolution de la LDL et de apo B-100 un véritable défi, qui ne peut pas encore être résolu avec les outils actuels. En mettant en ligne nos données brutes, et en présentant l’état de nos travaux actuels, nous espérons amorcer de nouvelles discussions en cryo-EM, et l’émergence de nouveaux algorithmes pour reconstruire de tels complexes.