Unbiased characterization of proteins on repaired chromatin : novel link between proteasomal degradation and meiotic recombination

Caractérisation non biaisée des protéines associées à la chromatine réparée : nouveau lien entre la dégradation protéasomale et la recombinaison méiotique La méiose est un processus hautement conservé chez les eucaryotes, assurant la diversité génétique grâce à la recombinaison homologue (HR), un mécanisme de réparation des cassures double-brin (CDB) programmées au cours de la prophase I. Si les grandes étapes de la recombinaison sont bien décrites, plusieurs aspects mécanistiques, dont ceux liés à la synthèse d'ADN, restent mal compris. Au cours de ma thèse, j'ai adapté la technique iPOND (isolation of Proteins On Nascent DNA) pour étudier la synthèse d'ADN liée à la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae. Développée à l'origine dans des cellules de mammifères, iPOND repose sur l'incorporation de l'analogue de thymidine, EdU, sa biotinylation via une chimie click puis la purification des protéines associées à l'ADN néo-synthétisé à l'aide de billes de streptavidine. Son adaptation à la levure a nécessité de surmonter des défis techniques majeurs, notamment l'absence de voie de récupération de la thymidine et une forte biotinylation endogène. J'ai mis en place un système d'import de thymidine efficace durant la méiose ainsi qu'une biotine-azide clivable permettant de réduire le bruit de fond. J'ai d'abord optimisé iPOND pendant la phase S pré-méiotique, identifiant par spectrométrie de masse plus de 400 protéines, incluant des polymérases, des facteurs de réplication (PCNA, RPA) et des protéines de la chromatine. J'ai ensuite appliqué cette méthode à l'étude de la synthèse d'ADN au cours de la réparation des CDB méiotiques. En combinant une incorporation d'EdU à un temps précis lors de la méiose avec une souche contrôle incapable de former des CDB, j'ai isolé le protéome spécifique de la recombinaison. Celui-ci comprend des acteurs majeurs de la réparation (Rad51, Rad52, RPA), des protéines de type ZMM qui promeuvent les crossovers ou CO (Zip2, Zip3, Zip4), des composants du complexe synaptonémal, et de façon inattendue, une sous unité du complexe ubiquitine-ligase SCF, la culline Cdc53. Ces résultats révèlent un lien inédit entre le système ubiquitine-protéasome et la recombinaison méiotique. Grâce à des tests d'interaction et à une analyse quantitative par spectrométrie de masse, j'ai mis en évidence des interactions entre Cdc53 et plusieurs protéines de recombinaison, dont Dmc1, l'orthologue méiotique de la recombinase Rad51, Zip2 et la sous-unité Mlh3 du complexe MutLg qui résout les intermédiaires de recombinaison en CO. J'ai montré que ces protéines sont poly-ubiquitinylées au cours de la méiose et stabilisées lors de l'inhibition du protéasome. Leurs interactions avec les protéines F-box Met30 et Cdc4 suggèrent que le complexe SCF régule leur dégradation et j'apporte notamment des arguments en faveur d'une dégradation spécifique de Mlh3 par le complexe SCFCdc4.Dans une seconde approche, j'ai exploré le protéome associé aux jonctions double de Holliday (dHJ). En utilisant une souche ndt80Δ, où ces structures s'accumulent, j'ai identifié des protéines de recombinaison précoces et tardives associées aux dHJs. Celles-ci comprennent les protéines ZMM ainsi que l'hélicase Sgs1. De manière surprenante, dans un mutant sgs1Δ qui voit ces structures résolues par des endonucléases spécifiques (Mus81-Mms4, Slx1-5 and Yen1), les protéines ZMM s'accumulent également sur les dHJ, suggérant indirectement un rôle tardif de Sgs1 dans la résolution des CO fait par la voie normale impliquant MutLg ainsi qu'un rôle des ZMM dans l'orientation de la résolution des dHJ dans la voie de CO de type II faite par les endonucléases structure-spécifiques. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis le développement d'une approche protéomique puissante pour étudier la dynamique de la recombinaison durant la méiose et révèle un nouveau niveau de régulation de la recombinaison méiotique impliquant le complexe SCF et le protéasome. Il ouvre la voie à des études fonctionnelles ciblées sur les protéines F-box méiotiques pour mieux comprendre leur rôle dans la recombinaison homologue.