Role of CTF18 and SAMHD1 in human DNA replication and genome integrity maintenance

Rôle de CTF18 et SAMHD1 dans la réplication de l'ADN et le maintien de l'intégrité du génome La phase S est une période critique du cycle cellulaire au cours de laquelle le génome est particulièrement vulnérable. La duplication efficace des génomes eucaryotes dépend de la progression de milliers de fourches de réplication. Les premières étapes de la tumorigenèse sont associées au stress de réplication spontané, caractérisé par un blocage de la fourche. Comprendre comment le stress de réplication survient dans les cellules normales et contribue à la tumorigenèse est un grand défi dans la recherche sur le cancer. Mon travail de thèse vise à comprendre la régulation de la progression de la fourche de réplication par deux protéines différentes,SAMHD1 et CTF18, qui participent à divers aspects du métabolisme de l'ADN.La duplication du génome dépend d'un approvisionnement équilibré de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP).Des pools de dNTP déséquilibrées augmentent les taux de mutation. SAMHD1 a été identifié comme une triphosphohydrolase de dNTPs. Cette enzyme est impliquée dans le syndrome d'Aicardi-Goutières. Récemment, il a été montré que SAMHD1 est impliquée dans la régulation des pools de dNTPs dans des cellules humaines. Cette protéine est exprimée au maximum pendant la quiescence et peu en phase S. Cependant, l'impact de SAMHD1 sur la réplication de l'ADN n'a pas encore été abordée. En utilisant la technique DNA fiber spreading, nous avons constaté que SAMHD1 module la vitesse de progression de la fourche. En plus de son activité de dNTPase, SAMHD1 contient un domaine putatif 3'-5 'exonucléase qui clive à la fois l'ADN et l'ARN in vitro. Un nombre croissant de preuves indique que les exonucléases 3'-5 'sont essentielles pour assurer la progression de la fourche et la fidélité de la réplication de l'ADN. Nous avons constaté que l'activité d'exonucléase de SAMHD1 favorise le backtracking des fourches arrêtées et qu'elle est requise pour la progression normale des fourches de réplication. Nous proposons que cette activité de backtracking est importante pour enlever désoxynucléotides ou ribonucléotides mal incorporés. Au-delà du cancer, notre découverte pourrait avoir des implications pour la compréhension du lien entre SAMHD1 et le syndrome d'Aicardi-Goutières. CTF18 fait partie d'un complexe de type RFC impliqué dans la cohésion des chromatides sœurs (CCS). Dans les cellules humaines, il a été suggéré que CTF18 contrôle la progression des fourches de réplication, en favorisant l'acétylation de la cohésine SMC3 à la fourche de réplication. Cependant, plusieurs résultats indiquent que la fonction de CTF18 n'est pas limitée à la mise en place de la CCS.En effet, notre groupe a montré que Ctf18 chez la levure est essentielle pour l'activation du checkpoint de la réplication, indépendamment de son rôle dans la CCS.Chez l'homme, CTF18 participe également au recrutement de PCNA, le facteur de processivité des ADN polymérases δ et ε. CTF18 interagit également avec la polymérase translésionnelle ƞ. Le but de mon travail était de caractériser le rôle de CTF18 lors de la réplication de l'ADN. En utilisant le peignage moléculaire, nous avons remarqué que la vitesse de la fourche de réplication est plus lente dans les cellules dépletés en CTF18 dans une phase S normale.Curieusement, l'augmentation de la vitesse de la fourche a été observée dans les cellules dépletés en CTF18 traités avec l'hydroxyurée (HU), qui ressemble au phénotype des cellules dépletés pour SAMHD1. Avec l'utilisation de la technique iPOND, nous avons observé une accumulation de PCNA aux fourches de réplication dans les cellules CTF18 traités avec HU. Nous avons également constaté que la déplétion de CTF18 induit une accumulation de yH2AX, ce qui suggère que CTF18 est nécessaire pour la stabilité du génome. Enfin, nous avons observé que la résection dépendante de SAMHD1 ne se produit pas en l'absence de CTF18. Collectivement, ces données indiquent que CTF18 agit en amont de SAMHD1 aux fourches arrêtées, probablement par le déchargement de PCNA.