Etude de l'hydrolyse enzymatique des galactolipides par diverses approches chromatographique et spectroscopiques

Les galactolipides sont les principaux constituants des membranes formant les thylacoïdes des chloroplastes des plantes, des algues et des cyanobactéries. Ils sont considérés comme la plus grande réserve d’acide gras sur la planète. La lipase pancréatique apparentée de type 2 (PLRP2) est une enzyme permettant à de nombres mammifères de digérer les galactolipides et d’accéder à cette importante source d’acide gras. Cette thèse a contribué au développement de diversesméthodes d’analyse pour l’étude de l’hydrolyse enzymatique des galactolipides, en particulier le monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), par la PLRP2 du cobaye (GPLRP2).Dans un premier temps, nous avons étudié l’hydrolyse d’un galactolipide synthétique à chainesacyles moyennes, le C8-MGDG en utilisant un outil classique de la lipidomique, lachromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la densitométrie. Le choix du réactif authymol et à l’acide sulfurique comme révélateur nous a permis de quantifier simultanément tousles composés galactosylés dans le milieu réactionnel. Les courbes cinétiques de la disparitionde MGDG et de la production de monogalactosylmonoacylglycerol (MGMG) et de monogalactosylglycerol (MGG) ont pu ainsi être établies. Le désavantage de cette méthode estqu’elle nécessite de stopper la réaction, d’extraire et de transformer les composés à quantifier,autant d’étapes qui augmentent l’erreur dans la quantification mais aussi le risque de l’évolutiondes composés avant leur révélation.Dans un second temps, la même réaction a été étudiée mais avec des outils moins fréquents en lipidomique, permettant de suivre l’hydrolyse en temps réel sans extraction ni transformation des composés à analyser. Le premier outil utilisé a été la spectroscopie infrarouge (IR), nécessitant de réaliser la réaction dans le D2O. L’enregistrement successif de spectres IR dumélange réactionnel au cours du temps a permis d’observer des changements importants dans les vibrations des carbonyle, carboxylate et méthylène. Ces changements ont été attribués à la consommation de MGDG et à la production de MGMG et d’acide octanoïque. L’étalonnage de l’absorption du MGDG, du MGMG et de l’acide octanoïque dans la région des vibrationsprécédemment citées a ensuite permis de quantifier ces composés à partir du spectre du mélange réactionnel. Par la spectroscopie infrarouge et par la CCM, la même activité spécifique de la GPLRP2 et les mêmes courbes cinétiques de disparition du substrat et d’apparition des produits ont été obtenues en étudiant la réaction dans le D2O. La chromatographie sur couche mince et la spectroscopie infrarouge nous ont aussi permis de mettre en évidence l’action direct de la GPLRP2 sur les galactolipides membranaires des chloroplastes. Enfin, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton a été utilisée pour analyser la même réaction dans le D2O. Contrairement à la CCM et à la spectroscopie IR, quin’ont pas permis de quantifier directement l’acide octanoïque et le MGG respectivement, laRMN a permis de quantifier à la fois le MGDG, le MGMG, le MGG et l’acide octanoïque grâceà l’intégration des pics de résonnance de certains protons identifiés. Outre l’obtention de la même cinétique qu’avec les deux premières méthodes, avec des données plus complètes, la RMN a permis aussi de caractériser les structures supramoléculaires dans lesquelles se trouvent les différents composés par l’estimation de coefficients de diffusion et de diamètres.hydrodynamiques en utilisant la RMN DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY)