Caracterización molecular de arenavirus del área endémica de la fiebre hemorrágica argentina: aislamientos de pacientes con diferentes patrones clínicos de FHA y nuevos arenavirus

Objetivos generales: caracterización molecular de los genomas de las variantes del virus Junín asociadas a diferentes formas clínicas de la fiebre hemorrágica argentina (FHA). La atención se circunscribirá al análisis de los genes correspondientes a las proteínas estructurales más abundantes: la proteína de la nucleocápside (N) y el precursor de las glicoproteínas virales (GPC) de las cepas prototipo estudiadas por McKee et al. (1987). Diseño de una metodología para detectar y caracterizar arenavirus del área endémica de la FHA. Se realizará la caracterización molecular de los arenavirus desconocidos que pudieran ser encontrados. Objetivos específicos: se cultivarán cepas con distinto grado de virulencia y se aislarán sus RNAs para luego obtener copias de cDNA. Éstos serán amplificados por PCR y se determinará la secuencia nucleotídica de los RNAs S completos. La caracterización de las cepas prototipo estará orientada a la búsqueda de alteraciones en el genoma de los RNAs S y al análisis de sus productos génicos (principalmente el precursor de las glicoproteínas virales, GPC), con el objeto de identificar cambios que pudieran estar asociados a los diferentes comportamientos biológicos. De la comparación de los genomas y productos génicos de variantes del virus Junín con distintos grados y patrones de virulencia se podrán sugerir las causas moleculares de los diferentes comportamientos biológicos observados. Además, se buscarán regiones conservadas en la secuencia nucleotídica de los RNAs S de diferentes arenavirus. Este análisis hará posible el diseño de un conjunto de primers generalizados que permitirían amplificar por RT-PCR regiones homólogas del genoma de los arenavirus. Los fragmentos amplificados serán caracterizados por RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) y/o por secuenciamiento nucleotídico. Se empleará la técnica de RT-PCR-RFLP para detectar y caracterizar, en forma rápida, aislamientos de arenavirus desconocidos o emergentes en programas de screening en poblaciones de roedores. La obtención de fragmentos solapados permitirá realizar un clonado rápido que abarque el RNA S completo de los arenavirus encontrados. Se realizará el análisis filogenético molecular a partir de la comparación de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas predichas de los diferentes arenavirus caracterizados. Dicho análisis permitirá relacionar los diferentes arenavirus reportados y realizar una clasificación que refleje las relaciones que surgen de la reconstrucción hipotética de la filogenia.