Unión de variantes de la Apolipoproteína A-I a ligandos celulares induciendo amiloidosis

La apolipoproteína A-I (ApoA-I) es un componente mayoritario de las lipoproteínas de alta densidad humanas (HDL), cuyos niveles elevados se correlacionan negativamente con el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. Un extenso campo de investigación atribuye la alta eficiencia de la ApoA-I a su participación en numerosas vías metabólicas que promueven el transporte reverso de colesterol y la protección de la función endotelial. A pesar de ello diferentes variantes naturales de la ApoA-I presentan una mutación puntual en la secuencia proteica (ya sea sustitución ó deleción), y se encuentran presentes en depósitos patológicos de amiloide. Al momento fueron descriptas más de 50 variantes naturales de esta proteína, de las cuales más de un tercio son asociadas con amiloidosis familiar. Un número importante de estas mutaciones se identifican en la región N-terminal (residuos 26-100) y su cuadro clínico se asocia principalmente con daño renal y hepático. Desde la descripción temprana de las diferentes variantes naturales, se ha investigado para arrojar luz sobre los eventos que determinan su depósito y el concomitante daño orgánico resultante. En este trabajo estudiamos y comparamos el efecto que la mutación pueda inducir en dos variantes naturales N-terminales de ApoA-I: la mutante surgida de una sustitución de Triptófano por Arginina en posición 50 (W50R, descripta en lesiones glomerulares renales), y la resultante del reemplazo de una Leucina en la posición 60 por una Arginina (L60R), la cual se encuentra involucrada en la formación de depósitos amiloides túbulo intersticiales. Los estudios involucraron una exhaustiva caracterización biofísica de la estructura de ambas variantes comparadas a la proteína con la secuencia nativa (Wt). Análisis de dicroísmo circular, fluorescencia y microscopía permitieron definir que a pesar de involucrar mutaciones de similar naturaleza química (reemplazo de un amino ácido no polar por uno positivo en el extremo N), la perturbación estructural que ocurre en W50R es sutil. En cambio, L60R adquiere una conformación más inestable, con pérdida de estructura secundaria y con mayor tendencia a la agregación. Más aún y quizá como consecuencia de lo anterior, esta variante es más susceptible a ser proteolizada, lo que pueda implicar un catabolismo incrementado ó la posibilidad de liberación de algún péptido que pueda per se poseer mayor tendencia a la agregación que la proteína con la secuencia completa. A continuación nos propusimos considerar el efecto de las modificaciones estructurales observadas en la interacción que pueda sufrir la ApoA-I con ligandos naturales. La alta flexibilidad estructural de esta proteína le permite interactuar con membranas biológicas adaptando su conformación, desde estructuras libre de lípidos hasta otras lipidadas, formando parte de las lipoproteínas de alta densidad humana (HDL). La utilización de un modelo de lípido negativo (dodecil sulfato de sodio) nos permitió evidenciar que incluso la proteína Wt podría dar lugar a conformaciones pro-amiloidogénicas ante compuestos o metabolitos circulantes. Más aún, es conocido que distintos cambios de situaciones fisio-patológicas podrían modificar la interacción con el microambiente. Así, analizamos el efecto de un ligero descenso de pH (como puede ocurrir en eventos pro-inflamatorios) sobre la interacción de las variantes con componentes de la matriz extracelular. Es sabido que los proteoglicanos (y sus glucosamino glicanos (GAGs) asociados, podrían favorecer la retención y/o agregación de proteínas. Usando como modelo de GAG a la heparina, pudimos determinar que ante un descenso de pH se incrementa la retención relativa de la variante W50R como compuesto pro-amiloide. Dada la riqueza de GAGs con alta carga negativa en los glomérulos, es importante sugerir que la razón de la presencia de esta variante en la corteza renal pueda deberse a su mayor retención local. Por último nos propusimos evaluar la hipótesis que los cambios conformacionales observados puedan resultar en una estructura que pueda generar el reconocimiento del sistema inmune innato despertando una respuesta pro-inflamatoria. Demostramos que en las condiciones experimentales ensayadas, L60R (pero no W50R) activa un modelo de macrófagos humanos, los cuales liberan el factor de necrosis tumoral α y la interleuquina-1β. Esta observación podría implicar que la generación de una respuesta pro inflamatoria podría incrementar y/o perpetuar la lesión. Como conclusión, los resultados mostrados en este trabajo permiten determinar que los eventos involucrados en la agregación patológica de variantes N terminales de la ApoA-I no son universales a pesar de ser las mutaciones de naturaleza química similar. Mientras que modificaciones leves en la estructura de la variante W50R modificarían su unión (y probable retención) con probables ligandos fisiológicos, la variante L60R experimenta alteraciones conformacionales que incrementan su agregación, grado de proteólisis y disparan la respuesta inflamatoria en un modelo de macrófagos humanos. Estos resultados sugieren fuertemente que la enfermedad crónica puede ser la consecuencia de una pérdida de estructura nativa de las proteínas, lo que rinde conformaciones que pueden ser citotóxicas o precursores de complejos amiloides. Sientan a su vez la base para futuras líneas de investigación que permitan establecer la génesis de la amiloidosis debida a ApoA-I y la órgano especificidad.