Neutron scattering and methodological developments for the study of the bacterial translocation machinery

Diffraction de neutrons et développements méthodologiques pour l'étude de la machinerie de translocation bactérienne La diffusion de neutrons à petits angles (SANS) est une méthode utilisée pour l'étude d'une large variété de particules en solution. Combinée à un marquage isotopique et à la variation de contraste, elle permet d'obtenir des informations structurales uniques sur des complexes biologiques impliquant plusieurs partenaires, la rendant particulièrement intéressante pour l'étude des mécanismes de translocation. Dans les trois grands domaines de la vie, jusqu'à 30% des protéines doivent être sécrétées hors de la cellule ou intégrées dans sa membrane. Ces mécanismes complexes impliquent deux grands chemins de translocation qui dépendent de multiples protéines cytoplasmiques et membranaires.L'Holotranslocon est un large complexe protéique membranaire composé de sept sous-unités : le translocon triméric SecYEG et les sous-unités accessoires SecD-SecF-YidC-YajC. Cet assemblage peut sécréter des protéines vers l'extérieur de la cellule et en intégrer dans la bicouche lipidique. Nous avons utilisé une sélection de méthodes biophysiques pour analyser différentes stratégies de préparation et la diffusion de neutrons pour analyser les caractéristiques structurales de ce complexe. Nous avons étudié l'efficacité des protocoles actuels pour la production d'un échantillon suffisamment concentré et homogène mais aussi la possibilité d'utiliser des Amphipols comme substitut aux détergents classiquement utilisés pour la purification de ce complexe. Nous avons également tenter de deutérer HTL pour étendre les possibilités offertes par le SANS dans ce contexte. Alors que les caractérisations biophysiques utilisées n'ont pas permis d'améliorer les méthodes de préparation actuelles, la diffusion de neutron nous a permis de confirmer la présence de lipides au centre de la structure. Nous avons assuré la fiabilité de cette stratégie pour étudier des complexes bien définis, formés par plusieurs composants. Nous proposons des méthodes alternatives, basées sur la fluorescence ou la génération de lipodisques, pour l'étude de ce système complexe.Nous avons également étudié la protéine tétramérique SecB, une chaperonne moléculaire qui est impliquée dans l'adressage des substrats de translocation aux translocons membranaires. Puisque SecB interagit avec des partenaires cytosoliques et ses propres substrats, nous avons utilisé la diffusion de neutrons ainsi que le marquage au deutérium pour analyser des complexes pertinents dans le processus de translocation et impliquant jusqu'à trois partenaires : SecB, un substrat déplié et l'ATPase SecA. Nous avons utilisé les valeurs de "contrast match point" mesurées pour obtenir des informations sur la stœchiométrie et l'affinité des différents assemblages. L'analyse des rayons de girations a permis de localiser les différents composants au sein de ces complexes. De plus, nous avons montré que SecB s'étend lorsqu'elle reconnait son substrat et nous proposons un modèle fonctionnel, basé sur nos données, pour l'adressage des protéines textit{via} le chemin post-traductionnel.Dans l'optique de diversifier les applications du SANS pour les systèmes biologiques, nous avons étendus les protocoles utilisés pour la production de protéines partiellement deutérées textit{in vivo} aux lipides et acides nucléiques bactériens. Les niveaux de deutération ont été analysés grâce à la diffusion de neutrons, spectrométrie de masse ou résonance magnétique nucléaire. Sur la base de ces données, nous avons extrapolé les niveaux de deutération et "contrast match point" pour chaque type de biomolécule afin de pouvoir prédire les conditions de cultures optimales requises pour atteindre un marquage spécifique. Nous avons, de plus, développé une nouvelle stratégie permettant de marquer sélectivement les protéines tout en conservant un marquage minimal des autres types de molécules.