Développement de thérapie génique par CRISPR/Cas9 appliquée aux myopathies liées à RYR1

La contraction des cellules dans le muscle squelettique est constituée d’une succession d’étapes qui nécessitent d’être finement régulées et sont dépendantes du calcium. La membrane plasmique des cellules musculaires est formée d’invaginations appelées tubules T. Chaque tubule T est entouré de deux citernes terminales du réticulum sarcoplasmique qui constitue les stocks calciques de la cellule. Enchâssés dans la membrane des tubules T sont localisés les récepteurs des dihydropyridines (DHPR). Ils sont en lien direct avec les récepteurs à la ryanodine de type 1 (RyR1). Ces canaux calciques sont eux localisés dans la membrane du réticulum sarcoplasmique. L’excitation de la cellule musculaire par le motoneurone induit une dépolarisation de la membrane plasmique, d’abord localisée. Puis, cette dépolarisation se propage jusque dans les tubules T et va activer les DHPR qui sont sensibles au voltage. Leur changement de conformation va permettre aux RyR1 de s’ouvrir et libérer le calcium dans le cytoplasme, engendrant la contraction des unités contractiles de la cellule, les sarcomères. L’ensemble des étapes allant de la dépolarisation de la membrane à la contraction des cellules musculaires constituent le couplage excitation contraction. L’homéostasie calcique est donc primordiale à la contraction et le canal RyR1 à un rôle clé dans les relâchements de calcium la régulant. Les myopathies liées à RyR1 sont un groupe de pathologies génétiques, toutes due à au moins une mutation dans le gène RYR1 codant pour le canal calcique du même nom. Ces pathologies ont toutes en commun une faiblesse musculaire. La sévérité peut être modérée à sévère suivant les cas. Il n’existe actuellement aucun traitement pour ces pathologies.Dans une première étude, notre équipe a fait la démonstration d’une approche de thérapie génique par saut d’exon par l’utilisation d’oligonucléotides antisens, applicable chez une famille atteinte d’une myopathie liée à RYR1. Malgré des résultats très satisfaisants, cette approche n’a pas pu être développée vers la clinique en raison de l’aspect ultra personnalisé de l’approche. Ce travail de thèse s’inscrit à la suite de cette étude, avec pour objectif de développer une approche moins personnalisé où un même traitement serait donc applicable à plus de patients en même temps. L’objectif de cette thèse était de réaliser une preuve de concept de thérapie génique par CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated protein 9) pour les myopathies liées à RYR1.Dans un premier temps, nous avons développé une stratégie de délétion intronique applicable à la même famille de patients que celle de la première étude menée par l’équipe. A travers ce projet, nous avons pu réaliser la délétion attendue dans des cellules de patients immortalisées. De plus, nous avons démontré le système utilisé pour maitriser la production de la nucléase SpCas9 dans les cellules dans le but de limiter au maximum l’activité off¬ target. Dans un second temps, nous avons utilisé CRISPR/Cas9 afin de développer de nouveaux modèles cellulaires à partir de cellules musculaires immortalisées issues d’un sujet sain. Ces nouvelles lignées ont un gène d’intérêt éteint et constituent de nouveaux outils pour l’étude du couplage excitation contraction, aussi bien dans un contexte physiologique que pathologique. Dans un troisième temps, nous avons développé une approche thérapeutique indépendante des mutations des patients. Cette approche vise l’allèle porteur de la mutation, et pourrait ainsi être applicable à tous les patients atteints de myopathies liées à RYR1 en raison d’une mutation à transmission dominante. De plus, cette approche pourrait également être applicable, sous certaines conditions, à d’autres pathologies.