Chemical RNA damage in neurodegenerative-related pathologies

Lésions chimiques de l'ARN dans les pathologies neurodégénératives Les espèces réactives de l'oxygène jouent un rôle crucial dans divers processus physiologiques, allant de la défense immunitaire à la régulation des gènes. Cependant, des niveaux élevés de ROS dus à des facteurs endogènes ou exogènes peuvent également conduire à l'oxydation spontanée de biomolécules, y compris l'ARN. Ces dommages oxydatifs peuvent entraîner la modification des nucléobases, la guanine étant une cible majeure en raison de son faible potentiel d'oxydoréduction. Par conséquent, la 8-oxoguanosine (oxo8G) a été signalée comme étant la lésion la plus abondante dans l'ARN. Le potentiel redox de l'oxo8G étant encore plus faible que celui de la guanine, ces sites oxo8G sont prédisposés à former d'autres produits d'oxydation tels que des lésions d'hydantoïne ou des sites abasiques. Des preuves de plus en plus nombreuses de la présence d'ARN oxydé dans les pathologies humaines, à savoir les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer, le vieillissement, les maladies cardiovasculaires et le cancer, suggèrent son rôle dans la progression de la maladie. Au niveau moléculaire, les bases oxydées de l'ARN peuvent provoquer des erreurs dans la traduction des protéines ou altérer la régulation posttranscriptionnelle de l'ARN. Malgré ces observations globales, les mécanismes sous-jacents qui relient l'ARN oxydé à la régulation des processus cellulaires et à la pathogenèse restent obscurs. L'état actuel de la technique ne permet pas de cartographier avec précision les dommages sur l'ARN au niveau d'un nucléotide, en particulier dans les ARN longs. Cette thèse de doctorat visait à développer une approche basée sur le séquençage pour cartographier les sites endommagés par l'oxydation dans l'ARN à une résolution d'un seul nucléotide. La chimie spécifique introduite dans l'approche AlkAniline-Seq permet de fragiliser l'oxo8G par un traitement alcalin et induit ensuite une rupture de brin par clivage avec l'aniline. En outre, l'adaptation d'un traitement chimique spécifique permet de différencier partiellement l'oxo8G de ses produits d'oxydation ultérieurs, y compris les sites abasiques. L'enrichissement positif des fragments clivés lors du traitement à l'aniline permet en outre de cartographier le site endommagé par l'oxydation à une résolution d'un seul nucléotide. Comme preuve de concept, nous avons d'abord validé notre méthode en utilisant un oligomère synthétique contenant de l'oxo8G et un site abasique à un endroit spécifique. L'application in vitro sur l'oligomère synthétique et l'IVT-tRNAAsp structuré traité avec HOCl a confirmé l'efficacité de la méthode. Une cartographie in vivo et in vitro des sites endommagés dans l'ARN de levure traité au HOCl a révélé des dommages oxydatifs qui se produisent différemment dans les cellules vivantes par rapport à l'oxydation in vitro d'ARN isolés ou de complexes ARN-protéines. Enfin, les profils RNA-seq des échantillons isolés à partir de modèles cellulaires humains de la maladie d'Alzheimer et de différents tissus de souris âgées ont révélé des schémas distincts dans les conditions pathologiques. Dans l'ensemble, ces résultats soulignent le potentiel de la méthode RNA-seq pour comprendre l'impact de l'oxydation de l'ARN en biologie.