Fidelity of family D DNA polymerases

Fidelité des ADN polymérases de la famille D La fidélité de la réplication de l'ADN est un processus fondamental qui se produit dans chaque organisme et qui est essentiel pour la stabilité du génome. Ce processus est assuré par des ADN polymérases réplicatives qui appartiennent à quatre familles différentes : A, B, C et D. J'ai étudié la fidélité de la réplication de l'ADN de la principale ADN polymérase réplicative chez les archées, PolD, une ADN polymérase de la famille D avec un site actif unique qui ressemble à celui des ARN polymérases. Pourtant, PolD est une ADN polymérase dépendante de l'ADN. J'ai utilisé plusieurs approches pour comprendre la fidélité de cette enzyme. Premièrement, j'ai utilisé la cryo-EM pour obtenir la première structure de PolD en mode exonucléase, et nous avons utilisé cette structure pour concevoir des mutants de PolD et comprendre la base moléculaire de l'activité exonucléase de cette polymérase unique. Ensuite, j'ai utilisé le séquençage de nouvelle génération pour mesurer la fidélité non seulement de PolD, mais aussi des membres des autres familles d'ADN polymérases réplicatives. Nous avons découvert que la mutation d'un résidu volumineux qui empêche l'incorporation de ribonucléotides (et donc la synthèse de l'ARN) augmente la fidélité de PolD in vitro.J'ai également mené des expériences supplémentaires pour comprendre les spécificités moléculaires de PolD, notamment une nouvelle structure intermédiaire de PolD avec l'ADN dans le site actif de la polymérase, avant que l'activité exonucléase ne soit déclenchée. De plus, j'ai étudié l'effet des bases endommagées sur le brin matrice sur PolD et PolB (l'ADN polymérase réplicative accessoire chez les archées). J'ai observé des spécificités différentes pour les deux polymérases en fonction du type de lésion rencontrée. Enfin, je présente un test à débit moyen pour déterminer les points de contrôle moléculaires pour la détection de l'incorporation de ribonucléotides dans PolD. Avec ce travail, nous avons élargi notre compréhension de la réplication de l'ADN et des mécanismes moléculaires qui régissent la synthèse de l'ADN à haute fidélité chez les archées.