Structural characterization of bacterial defense complex

Caractérisation structurale d'un complexe de défense bactérienne De nos jours, la résistance aux antibiotiques développée par des pathogènes bactériens est de plus en plus répandue, et en conséquent il devient primordial de caractériser de nouvelles cibles bactériennes potentielles. Les alpha2-macroglobulines (α2Ms) sont des inhibiteurs de protéases à large spectre jouant un rôle clé dans l’immunité eucaryote. Ce sont des molécules multi domaines d’environ 1800 résidus qui arborent une séquence en acide nucléique très spécifique appellée « bait site » qui est reconnu et couper par un très grand nombre de protéases. Durant ce clivage, la nouvelle conformation de la protéine entraine l’exposition de la liaison thioester entre une cystéine et une glutamine, qui est alors hydrolysée, permettant ainsi au glutamate résultant de s’associer de façon covalente à la protéase cible, et d’être piégé dans la structure en forme de cage de α2M. Des homologues de a2M provenant de bactéries colonisées et pathogéniques ont récemment été caractérisés. Ces nouvelles recherches suggère que la bactérie dispose un système immunitaire capable de mimer les étapes clés initiales du système immunitaire eucaryote et que celui-ci pourrait constituer une cible encore inexploitée en biologie pathogène.On retrouve dans le génome bactérie deux types de gènes pour a2M: celui de type 1 qui contient la liaison thioester et celui de type 2 qui n’en dispose pas. De façon intéressante, le a2M bactérien de type 1 est situé de façon persistante dans le même opéron que le gène codant pour une enzyme de biosynthèse de la paroi cellulaire appelée Penicillin-binding Protein 1c (PBP1s). Cela suggère qu’une association étroite entre ces deux protéines pourrait être très avantageuse pour la cellule, spécialement durant l’infection et/ou la colonisation où la membrane cellulaire externe est ciblée par des agents de défense de l’hôte. Dans cette situation, A2M et PBP1C pourraient exercer les rôles de « gardiens du périplasme » avec PBP1C réparant les dommages causés au niveau du peptidoglycane et A2M traquant les protéases invasives.Le but de ce travail est donc de démontrer l’existence de ce complexe PBP1C/A2M et de caractériser cette interaction de façon structurelle et fonctionnelle. Dans ce sens, les deux protéines provenant d’E. Coli ont été étudiées, ainsi qu’exprimées et purifiées séparément. La protéine Α2M (également appelé ECAM dans E.Coli) est très soluble, exprimée de façon monomérique à une taille de 182kDa, monodispersée et stable dans l’échelle de temps. PBP1c est une protéine se fixant à la membrane, d’une taille de 87kDa et présente de façon prédominante en tant que dimère. La reconstitution du complexe in vitro par incubation et mélange des deux protéines pendant 2 heures a permis d’obtenir un complexe PBP1C/ECAM, dont la présence a été prouvée par un nouveau pic caractéristique sur chromatographie par exclusion de taille. Ces résultats ont également été appuyés par SDS-PAGE, centrifugation analytique et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). ECAM et PBP1c s’associent à des ratios stœchiométriques de 2/2 et 4:4. Enfin, un test d’activité a permis de confirmer tout d’abord le rôle de PBP1s dans la polymérisation les chaines glycanes mais aussi que cette activité est amplifiée en présence d’ECAM.Les essais cristallographiques ont permis d’obtenir des cristaux de PBP1c dans différentes conditions. De plus l'étude d’ECAM par microscopie électronique a prouvé que la technique était applicable pour des études structurelles du complexe. De ce fait, après optimisation, ces deux approches pourraient être la solution envisagée pour la caractérisation structurelle du complexe ECAM/PBP1c.