Localisation, dynamique et organisation nanométrique de la molécule d'adhérence synaptique neuroligine-1

Les neuroligines sont des molécules d’adhérence cellulaires essentielles au développement et à la fonction des synapses, et sont par ailleurs la cible de mutations génétiques délétères associées aux troubles du spectre autistique chez l’homme. Dans cette thèse, j’ai souhaité élucider la localisation synaptique, la dynamique membranaire et l'organisation à l'échelle nanométrique de la neuroligine-1 (NLGN1). Dû au manque d’anticorps efficaces pour la visualisation et la purification de la NLGN1 endogène, des stratégies alternatives d’inactivation génique, de surexpression ou de remplacement de la NLGN1 par des formes recombinantes ont été développées, aboutissant à des résultats controversés. J’ai tout d’abord eu recours à de telles stratégies afin d’étudier la dynamique et l’organisation nanométrique de protéines NLGN1 étiquetées, démontrant un temps de résidence synaptique important qui suggère une stabilisation de la NLGN1 aux synapses via de multiples interactions extracellulaires et intracellulaires. Dans un second temps, j’ai utilisé une nouvelle lignée de souris knock-in bAPNLGN1 conceptualisée dans l'équipe, qui permet de s’affranchir de la manipulation du niveau d’expression de la NLGN1. Chez cette souris, la NLGN1 endogène a été fusionnée à un petit peptide accepteur de biotine (bAP), pouvant être biotinylé de façon cellule-spécifique, puis marqué avec des conjugués de streptavidine ayant une très forte affinité pour la biotine. Après avoir montré par immunocytochimie que l’insertion de l’étiquette bAP n’a pas d’effet sur la taille et le nombre de synapses excitatrices et inhibitrices formées (en comparaison d’un groupe de souris sauvages), j’ai exploité ce nouvel outil pour la purification et la visualisation de la NLGN1 endogène dans des cultures de neurones dissociés. J’ai montré par pull-down que la NLGN1 peut se lier aux autres isoformes NLGN2 et NLGN3, ainsi qu’à la PSD-95 et la géphyrine, des protéines d’échafaudage respectives des synapses excitatrices et inhibitrices.En visualisant la NLGN1 endogène par microscopie à épifluorescence, j’ai démontré sa localisation à la fois aux synapses excitatrices et inhibitrices. Enfin, par imagerie de super résolution dSTORM, j’ai montré que la NLGN1 s’organise en nano-domaines, dont le nombre augmente proportionnellement à la taille de la post-synapse, et qui sont alignés avec des domaines de protéines présynaptiques (neurexine-1β, RIM1/2). Ce travail apporte ainsi un nouvel éclairage sur la localisation et l’organisation nanométrique de la NLGN1 endogène,remettant en cause le point de vue historique selon lequel la NLGN1 est spécifique des synapses excitatrices. À l’avenir, cette nouvelle souris KI permettra d’étudier la localisation de la NLGN1 dans des modèles de culture 3D (neurosphères), y compris dans des cellules non neuronales (astrocytes). Elle pourra aussi servir de standard pour ajuster le niveau d’expression de NLGN1 mutées à celui de la protéine endogène, afin d’étudier l’impact de ces mutations sur l’organisation et la fonction synaptique.