New activity-based probes to detect matrix metalloproteases

Nouvelles sondes d'affinité pour la détection de metallo proteases de la matrice Les Métallo Protéases Matricielles (MMP) en tant qu'endopeptidases à zinc ont une large gamme de fonctions biologiques allant du remodelage tissulaire à la modulation de la réponse cellulaire. Une modification de leur activité protéolytique est souvent associée à de nombreux désordres biologiques. In vivo, ces protéases sont soumises à de nombreuses modifications post-traductionnelles. Elles sont sécrétées sous formes latentes à l'extérieur des cellules pour être ensuite transformées en forme fonctionnelles. Ces dernières sont ensuite inhibées par des inhibiteurs endogènes. En raison de leur sécrétion dans l’espace extra cellulaire, les MMP sous formes actives ont longtemps été considérées comme de simples ciseaux moléculaires capable de dégrader uniquement la matrice extracellulaire. Cependant, le remodelage tissulaire ne constitue pas la fonction unique et encore moins la fonction principale de ces enzymes. Elles peuvent en effet cliver une grande variété de substrats non matriciels et à ce titre sont impliquées dans la progression tumorale, l'immunité et l'inflammation. Pour ajouter une complexité supplémentaire à la biologie des MMP, il a été récemment montré que certaines MMP ont une localisation intracellulaire associée à des fonctions non protéolytiques. Ces observations, mais aussi celles montrant que ces protease participent à la progression de la maladie alors que d'autres ont une fonction protectrice, soulignent la nécessité de mieux documenter leur activation spatiale et temporelle dans divers contextes biologiques.Le profilage protéique basé sur l'activité vise à analyser l'état fonctionnel des protéines dans des échantillons biologiques complexes. À cette fin, des sondes basées sur l'activité (ABP), qui réagissent avec les enzymes en s’appuyant sur leur mécanisme catalytique, ont été développées pour la détection d’enzymes sous formes actives, notamment dans le cas des protéases à sérine et à cystéine. Une sonde basée sur l’activité (ABP) est classiquement composée : i) d’un groupement réactif conduisant à la modification covalente de résidus au sein du site actif de l’enzyme, ii) d’un motif de liaison imposant la sélectivité au groupement réactif et iii) d’un groupement rapporteur permettant la détection des enzymes ciblées. Cette approche ne s’applique toutefois pas aux MMP, pour lesquelles il n’existe pas de résidus nucléophiles conservés au sein du site actif. À cet égard, tous les ABP ciblant les MMP comportent un groupement photo activable qui, sous irradiation UV, favorise la formation du complexe covalent. De telles sondes photo sensibles ont permis de détecter les MMP sous leurs formes actives dans des tissus et des fluides, mais pas chez les animaux vivants au sein desquels l’étape de photo-activation ne peut être réalisé.Dans ce contexte, en nous appuyant sur un contexte structural favorable et en exploitant la chimie de l'acyl imidazole (LDAI) dirigée par un ligand, nous avons identifié une nouvelle série de sondes capables de modifier de manière covalente les MMP sans recourir à la photo-activation. Nous avons ainsi validé la capacité de ces sondes à marquer de manière sélective et efficace la MMP12 humaine in vitro et dans des protéomes complexes. Dans ce dernier cas, jusqu’à 50ng de hMMP12 correspondant à 0,05% du protéome total peuvent être détectés. Nous avons également déterminé l'identité de l’unique résidu modifié de façon covalente au sein du site actif de la hMMP-12 et vérifié que cette modification avait peu d'impact sur l’activité protéolytique de cette dernière. Nous avons démontré que cette approche permettait de détecter des MMP endogènes. Enfin, nous avons étendu cette stratégie de marquage à un panel plus large de MMP.En développant la première stratégie de marquage des formes actives de MMP «sans photo-activation», il semble maintenant possible d’envisager la détection de ces enzymes à la fois dans les protéomes complexes et in vivo.