Allosteric modulation of follicle stimulating hormone receptor and GPR54 : new tools to study signalling

Exploration et modulation de l'efficacité de transduction du récepteur FSH à l'aide d'anticorps conjugués Le GPR54 et le RFSH régulent la reproduction en agissant sur l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades (HPG). En agissant dans l’hypothalamus, GPR54 est un régulateur proximal de l’axe tandis que le RFSH contrôle la gamétogenèse dans les deux sexes. Ils représentent deux cibles thérapeutiques majeures pour le traitement des problèmes liés à la fertilité. GPR54 et RFSH appartiennent à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). GPR54 active préférentiellement la voie Gαq/PLC/Ca2+ alors que le RFSH induit principalement la voie Gαs/PKA/cAMP. Les deux récepteurs recrutent et activent les β-arrestines. Un nombre croissant de profils pharmacologiques ont été décrits pour agir sur des GPCR. En effet, des ligands biaisés, capables d’activer préférentiellement un sous-ensemble du répertoire de signalisation par rapport aux ligands endogènes, sont découverts à un taux élevé. Les ligands orthostériques et allostériques peuvent induire des biais en stabilisant des conformations particulières des récepteurs. Sur le plan thérapeutique, les ligands biaisés ont démontré leur potentiel à induire des effets thérapeutiques tout en évitant les effets indésirables. De plus, les ligands allostériques permettent le modulation positive ou négative d’un récepteur tout en conservant l’information temporelle associée au ligand endogène. Jusqu’il y a peu, des outils pharmacologiques aussi divers et intéressant n’existaient pas pour GPR54 ni pour RFSH. L’objectif de cette thèse a donc été d’identifier des ligands allostériques de GPR54 et du RFSH puis, de caractériser leur signalisation biaisée. Dans la première partie, nous avons caractérisé les propriétés pharmacologique d’un panel de composés de faible poids moléculaire, décrits récemment pour être des modulateurs allostériques du FSHR et appartenant à deux classes chimiques différentes. Nous avons profilé leurs actions sur différentes voies de signalisation dans des cellules HEK293 vivantes exprimant différents biosenseurs. Nous avons démontré que chacun de ces composés induisait des biais par comparaison à la FSH. En comparant différents modèles cellulaires, nous avons confirmé que les biais de système représentent un facteur de confusion crucial pour la détermination des biais. Nous avons également identifié des cas limites pour lesquels le modèle opérationnel n’a pas permis de calculer les facteurs de biais. En parallèle, nous avons caractérisé deux nouveaux composés appartenant à des classes chimiques qui n’avaient jamais été décrites pour activer le RFSH. Nous avons démontré qu’ils étaient allostériques et que leurs profils de biais étaient distincts de ceux des autres composés caractérisés. Dans la seconde partie, nous avons sélectionné and caractérisé des nanobodies ciblant GPR54 et RFSH. Nous avons identifié un nanobody exerçant un effet de modulateur allostérique positif (PAM) sur GPR54. Nous avons aussi identifié un nanobody ciblant le RFSH. Ce dernier présentait des propriétés biaisées originales puisqu’il était modulateur allostérique négatif (NAM) pour la voie AMPc mais PAM pour le recrutement de β-arrestine 2. Dans la dernière partie, nous avons essayé de développer des conjugués nanobody-drogue (NDC) en liant nos nanobodies à des agonistes – soit kisspeptin, soit un des composés agonistes que nous avons caractérisés dans la première partie – à l’aide d’un linker flexible. Bien que nous n’ayons pas eu le temps d’obtenir une preuve de concept pour les NDC, cette stratégie nous semble au minimum prometteuse en tant qu’outil de recherche. Dans sa globalité, cette thèse propose de nouveaux outils pharmacologiques qui vont permettre de comprendre les contributions relatives des différentes voies de couplage de GPR54 et du RFSH, in vivo, sur la fonction de reproduction. Ce travail ouvre également de nouvelles pistes thérapeutiques pour contrôler la reproduction chez les animaux d’élevage et en médecine de la reproduction.