Abstrak Jamur shiitake (Lentinula edodes) merupakan salah satu jenis jamur pangan yang menghasilkan metabolit sekunder dengan potensi sebagai bahan obat. Metabolit sekunder jamur dapat diperoleh dengan cara ekstraksi dari tubuh buah, miselium, maupun filtrat kulturnya. Pertumbuhan dan produksi metabolit sekunder jamur dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor eksternal seperti pH dan waktu inkubasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai pH dan waktu inkubasi yang optimal bagi pertumbuhan miselium jamur L. edodes serta golongan metabolit sekunder yang dihasilkan. Penelitian dilakukan secara eksperimental RAL Faktorial dengan dua faktor, yaitu faktor pH (pH 3, 4, 5, dan 6) dan waktu inkubasi (15, 20, 25, dan 30 hari) sehingga terdapat 16 kombinasi perlakuan yang diulang sebanyak 3 kali. Variabel bebas penelitian berupa pH dan waktu inkubasi, serta variabel terikat berupa pertumbuhan miselium dan golongan metabolit sekunder yang dihasilkan. Parameter utama penelitian ini adalah bobot kering miselium dan golongan metabolit sekunder yang dihasilkan, serta parameter pendukung berupa pH akhir medium pertumbuhan. Data bobot kering miselium dianalisis menggunakan ANOVA dan uji lanjut DMRT pada tingkat ketelitian 95%, sedangkan data identifikasi golongan metabolit sekunder dianalisis secara deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pH medium dan waktu inkubasi dapat memengaruhi peningkatan pertumbuhan miselium jamur L. edodes, namun tidak ditemukan interaksi antara keduanya. Nilai pH yang optimal untuk pertumbuhan miselium L. edodes berada pada kisaran pH 5-6 dan waktu inkubasi yang optimal berada pada kisaran waktu 20-30 hari. Berdasarkan uji Kromatografi Lapis Tipis, miselium dan filtrat kultur jamur L. edodes diketahui mengandung senyawa metabolit sekunder dari golongan alkaloid, terpenoid, dan flavonoid. Kata kunci: Lentinula edodes, metabolit sekunder, pH, waktu inkubasi.