Development of a novel method for genomic mapping of AP sites using polyamine reagents

Développement d'une nouvelle méthode pour la cartographie génomique de sites AP utilisant les réactifs polyamines Depuis leur découverte à la fin du XXᵉ siècle, les sites abasiques, ou apuriniques/apyrimidiques (AP) restent encore une forme énigmatique de dommage à l'ADN. Aujourd'hui, ils sont reconnus comme l'une des lésions de l'ADN les plus répandues, se formant spontanément ou sous l'effet de facteurs enzymatiques et environnementaux. Ces lésions de l'ADN jouent un rôle crucial dans l'instabilité génomique, contribuant à la mutagenèse et à la pathogenèse de diverses maladies. Sur le plan biologique, leur formation et leurs mécanismes de réparation sont bien caractérisés, avec des causes et des conséquences largement comprises. D'un point de vue chimique, la structure et la réactivité des sites AP ont été largement étudiées, révélant leur nature électrophile unique et leurs interactions avec la machinerie cellulaire ainsi qu'avec les petites molécules d'origine endo- ou exogène. Malgré ces avancées majeures, une question clé est restée en suspens jusqu'à récemment : la répartition des sites AP au sein du génome. Répondre à cette question est essentiel pour mieux comprendre l'impact global des sites AP sur la stabilité du génome et le fonctionnement cellulaire. Pour cartographier les sites AP dans le génome, une stratégie de marquage très spécifique est nécessaire afin de distinguer les sites AP des autres modifications de l'ADN possédant également une réactivité de type aldéhyde, notamment le 5-formyluracile (5-fU) et la 5-formylcytosine (5-fC). Par ailleurs, une approche de séquençage capable de cartographier ces sites dans l'ensemble du génome est indispensable. Cela nécessite l'intégration de domaines interdisciplinaires, allant de la biologie chimique à la bioinformatique, pour analyser et interpréter la distribution de ces lésions. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans le marquage et le ciblage des sites AP, les méthodes actuelles présentent encore des limites en termes de sélectivité, d'efficacité et de compatibilité avec le séquençage à haut débit. Dans cette thèse, nous avons répondu à cette question en développant une nouvelle méthode de marquage spécifique des sites AP, en exploitant leur réactivité inédite avec les polyamines découverte il y peu de temps. Nous avons démontré que les polyamines réagissent sélectivement avec les sites AP par rapport aux autres modifications de l'ADN de type aldéhydique, telles que 5-fU et 5-fC, en formant un nouveau type d'adduits (AP-X, ou « ribodiazépanes »). En utilisant les petites molécules mimant les sites AP, nous avons établi la structure chimique des adduits AP-X et proposé un mécanisme de leur formation. Nous avons également démontré que les adduits AP-X sont stables face à plusieurs réactifs, tels que les agents réducteurs et les traitements acides, ainsi qu'aux enzymes de réparation de l'ADN, comme APE1 et TDP1. Ainsi, les polyamines telles que le bis-naphtalène BisNP-½ représentent des outils prometteurs pour le marquage chimique sélectif des sites AP. En utilisant cette nouvelle réaction, nous avons développé un protocole pour le marquage chimique spécifique et l'isolement par précipitation sur les billes de fragments d'ADN portant des sites AP, qui peuvent ensuite être utilisés pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) et la cartographie génomique par l'analyse bioinformatique. En utilisant cette méthode, nous avons obtenu et comparé des cartes de sites AP dans le génome de cellules HepG2 traitées ou non par des agents génotoxiques.